طرق وكيفية زراعة وعزل الكائنات الحية الدقيقة بصورة نقية , Pure Isolation of microorganisms

تمهيـد :

توجد الكائنات الحية الدقيقة في الطبيعة بصورة مختلطة لأنواع عديدة منها ولكي نتمكن من دراسة الأنواع المختلفة من الكائنات الدقيقة وتأثيراتها البيئية وتفاعلاتها مع البيئة والكائنات الأخرى وإمكانية الإستفادة منها يجب عزلها بصورة نقية وفي ظروف معقمة خالية من أي تلوث بكائنات أخرى بحيث تنمو كل خلية مكونة مستعمرة Colony من عدة خلايا وكل مستعمرة منفصلة عن غيرها وهذه نحصل عليها من تنمية الكائنات الدقيقة على بيئات صلبة أما البيئات السائلة فتكون الخلايا مختلطة مع بعضها ولكن لكل نوع من البيئات هدف من استخدامه كوسط لتنمية الكائنات الدقيقة .
وهناك عدة طرق يمكن اتباعها لتحقيق غرض الحصول على أنواع محددة من الكائنات الدقيقة مع الأخذ بعين الإعتبار أن هناك أوساط غذائية ( اختيارية ) يمكن لنوع معين من الكائنات الدقيقة النمو عليها دون غيرها من الأنواع .
ملاحظة : يمكن الحصول على الأنواع المختلطة من البكتيريا أو الفطر من أطباق العزل من الهواء أو التربة وغيرها أو من تنمية عدة أنواع في بيئة سائلة ثم تنميتها على أطباق الآجار المغذي ثم اتباع إحدى الطرق المستعملة في تنقية المزارع المختلطة للحصول على الأنواع النقية المفردة كما سيرد لاحقاً .
ومن هذه الطرق المستخدمة لعزل الكائنات الدقيقة :

أ- طريقة التخطيط على سطح الآجار المتصلب Streak-plate method .

يستخدم في هذه الطريقة عملية تخفيف غير مباشرة تهدف إلى التفريق بين الخلايا ذات العدد الكبير وذلك باستخدام ما يعرف بإبرة التلقيح ذات العقدة needle loop أو إبرة التلقيح المعقوفةbent-needle وذلك بنشر الخلايا على سطح البيئة الغذائية في الطبق وهذا ما يعرف بالتخطيط Streaking .
ومن الطرق الشائعة في التخطيط على الأطباق :
1- التخطيط المتعرج الأحادي : ويهدف إلى الحصول على أنواع مفردة من الكائنات الدقيقة .
2- التخطيط المتعرج الثلاثي : ويهدف إلى الحصول على أنواع مفردة من الكائنات الدقيقة ويمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على مستعمرات أكثر تباعداً ونقاءاً .
3- والتخطيط المتوازي : للحصول على مستعمرات متفرقة وكذلك يمكن استخدامها في تجارب دراسة العلاقات البيئية بين الكائنات الدقيقة مثل التضاد والتكافل .
4- التخطيط المتقاطع ( إما مستقيماً أو متعرجاً ) .
وبشكل عام تبدأ عملية التخطيط على الأطباق بأخذ قطرة بإبرة التلقيح من حافة طبق مزروع عليه بكتيريا مسبقاً أو من أنبوب به بيئة سائلة تحتوي على نمو بحيث تبدأ بالتخطيط من الجهة البعيدة عنك في الطبق إلى الجهة القريبة منك ذهاباً واياباً بخطوط متوازية ملامساً سطح الآجار .

المواد والأدوات اللازمة :

أطباق بتري – بيئة الآجار المغذي المسالة – إبرة تلقيح ذات العقدة وأخرى مستقيمة – أنابيب اختبار معقمة – مزارع للفطريات و البكتيريا بها أنواع مختلطة – لهب .

طريقة العمل :
قبل البدء بالعمل يجب مراعاة ظروف التعقيم لجميع المواد والأدوات المستعملة .
1- خذ من المزرعة المختلطة مسحة من على سطح أحد المستعمرات بواسطة إبرة التلقيح ذات العقدة مع مراعاة ظروف التعقيم .
2- ارفع غطاء طبق بتري محتوٍ على الوسط الغذائي بالقرب من اللهب ثم خطط سطح الآجار بالطريقة الأولى .
3- كرر الخطوة الثانية باتباع الخطوات الثلاثة الأخرى في التخطيط كما في الشكل.
4- حضن الأطباق في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة .

ب – طريقة التخطيط على الآجار المائل :

وتهدف هذه الطريقة إلى عزل المستعمرات المختلطة بصورة نقية وكذلك يمكن استخدامها لحفظ الأنواع النقية من الكائنات الدقيقة لفترة طويلة لاستخدامها عند الحاجة وكذلك لمعرفة طبيعة الحركة أثناء نمو البكتيريا على الآجار المائل وكذلك تحديد الصفات المزرعية مثل تكوين الصبغات .
وتحضر هذه الأنابيب بصب بيئة محتوية على الآجار وهي في حالة سائلة ثم وضعها في المعقم وبعد التعقيم توضع الأنابيب بشكل مائل وهي في حالة سائلة بحيث يتشكل لدينا سطح مائل من الوسط الغذائي ثم يترك ليبرد ويتصلب .

طريقة العمل :

1- عقم إبرة التلقيح ذات العقدة باللهب ثم اتركها تبرد .
2- إلمس المستعمرة الفردية المراد نقل جزء منها إلى سطح الآجار المائل .
3- أرفع سدادة القطن من الأنبوب باستعمال الإصبع الصغير لليد الأخرى وعقم فوهة الأنبوب بتعريضه للهب .
4- انشر اللقاح على سطح الآجار المائل بالتخطيط المتعرج أو بعمل خط مستقيم على سطح البيئة من الأسفل إلى الأعلى .
5- عقم فوهة الأنبوب مرة أخرى ثم أغلق الأنبوب بالسدادة القطنية .
6- كرر العملية باستخدام أنواع أخرى من البكتيريا .
7- ضع الأنابيب في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة.

ج – تلقيح الآجار العميق ( المستوي ) :

تهدف هذه الطريقة لمعرفة طبيعة الحركة في النمو البكتيري وتوفير الوسط اللاهوائي لنمو الميكروب .
1- عقم الإبرة المستقيمة .
2- المس المستعمرة المراد نقل جزء منها إلى الآجار العميق ( نصف الصلب ) .
3- إرفع سدادة القطن من الأنبوب باستعمال الإصبع الصغير لليد الأخرى وعقم فوهة الأنبوب .
4- أوخز السلك المستقيم المحتوي على اللقاح من المنتصف حتى ثلثي الأنبوب ثم اسحب السلك بعناية ثم ضع سدادة القطن مكانها .
5- كرر العملية باستخدام أنواع أخرى من البكتيريا .
6- حضن الأنبوب في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة .
د- تلقيح البيئة السائلة في أنابيب :

يمكن من خلال هذه الطريقة معرفة طبيعة البكتيريا من حيث احتياجها للهواء ( هوائية أو لاهوائية ) وذلك بملاحظة النمو داخل البيئة وكذلك ملاحظة طبيعة وكثافة النمو السطحي أو تكون الراسب في الأنبوب ومدى العكارة الناتجة من النمو البكتيري وذلك لتقدير النمو الميكروبي .

طريقة العمل :
1- عقم إبرة التلقيح ذات العقدة باللهب .
2- المس المستعمرة المراد نقل جزء منها إلى الآجار السائل .
3- ارفع سدادة القطن من الأنبوب باستعمال الإصبع الصغير لليد الأخرى وعقم فوهة الأنبوب .
4- اخلط اللقاح مع البيئة في الأنبوب جيداً ثم ارجع السدادة القطنية في مكانها بعد تعقيمها.
5- كرر العملية باستخدام أنواع مختلفة من البكتيريا .
6- ضع الأنابيب في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة

هـ طريقة الأطباق المصبوبة Pour plate method :
يمكن هنا الحصول على المستعمرات النقية من خلال اختلاط البيئة مع العينة ( الكائن الدقيق ) كلياً وتظهر بعض المستعمرات على السطح وبعضها يكون مدفوناً في الوسط الغذائي وذلك بعد تحضينها . وتتم عملية التلقيح والآجار لا زال سائلاً .
وهنا يتم تلقيح الوسط الغذائي لدراسة تأثير بعض الكائنات على العناصر أو تأثرها بها مثل أثر بكتيريا الستربتوكوكاس على خلايا الدم . ويصاحب هذه الطريقة عادة استخدام تخفيف للعينة الأصلية للحصول على مستعمرات منتشرة بشكل جيد للتمكن من الدراسة والحصول على النتائج بشكلٍ جيد .
ملاحظة : يمكن خلط الوسط الغذائي بالميكروب في أنبوب محتوٍ على الآجار المغذي مسال ثم صبه في طبق بتري وتركه يتصلب أو بخلط الميكروب في ماء مقطر ومعقم في أنبوب ثم نقله إلى طبق بتري به الآجار المغذي غير متصلب .

طريقة العمل :
1- عقم ابرة التلقيح ذات الحلقة وخذ مسحة من اللقاح المراد أخذ العينة منه وكرر العملية مرتين .
2- خذ أنبوب يحتوي على ماء معقم ومقطر وافتح الأنبوب ثم اخلط اللقاح بالماء جيداً بطرقه بواسطة الأصبع أو بلفه بين راحتي اليد .
3- خذ طبق بتري وضع فيه الآجار المغذي المسال ثم خذ 1 مل من الأنبوب بواسطة ماصة نظيفة معقمة وضعها في الطبق ثم اخلط جيداً بحركة دائرية خفيفة تارة مع حركة عقارب الساعة وتارة عكس عقارب الساعة .
4- اترك الطبق حتى يتصلب .
5- ضع الطبق في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة .
6- كما أسلفنا سابقاً يمكن عمل عدة تخفيفات للعينة الأصلية للحصول على مزارع منفصلة حتى يسهل التعامل معها ثم تكرار الخطوات السابقة لكل تخفيف .

و- طريقة الأطباق المنتشرة Spread plate method :
ويمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على نمو كثيف يغطي سطح الطبق كاملاً لاستخدامه في الدراسات الفسيولوجية للكائنات الدقيقة مثل تحلل المواد الغذائية بالإنزيمات الميكروبية ودراسة تأثير العوامل البيئية وبعض المواد على نمو الكائنات الدقيقة .
وتتم هذه العملية بنشر النمو على سطح الوسط الغذائي المتصلب بشكل كامل على خلاف طريقة التخطيط أو طريقة الأطباق المصبوبة .

طريقة العمل :
1- عقم إبرة التلقيح ذات العقدة وخذ مسحة من اللقاح المراد أخذ العينة منه وكرر العملية مرتين .
2- خذ أنبوب يحتوي على ماء معقم ومقطر وافتح الأنبوب ثم اخلط اللقاح بالماء جيداً .
3- خذ طبقاً بترياً محتوٍ على الآجار المغذي المتصلب وضع على سطح البيئة 0.1 ملل من الأنبوب .
4- خذ مرود معقم Swab أو ساق زجاجية معقوفة معقمة وقم بفرد اللقاح على سطح الآجار المغذي جيداً .
5- ضع الطبق في الحضان عند 37 ْم لمدة 36-48 ساعة .

* خذ القراءات التي تحصل عليها في كل تجربة مراعياً شكل المستعمرات وطبيعة النمو مستعيناً بعمل جدول خاص لكل عمل وكذلك استخدام الرسم ما أمكن لتوضيح النتائج .

ملاحظة هامة :
للتأكد من أن عمليات العزل تمت بنجاح و الحصول على المزارع النقية يتم فحص المستعمرات النامية فإن كانت الخلايا كلها متشابهة في الشكل والحجم فقد تمت عملية العزل بنجاح .
ولعزل المستعمرات الفطرية نستخدم طرق أخرى مشابهة نوعاً ما مع الطرق المستخدمة للعزل النقي للبكتيريا غير أن عملية أخذ العينة الفطرية تتم بأخذ مسحة من الأبواغ بإبرة التلقيح أو بأخذ قرص من النمو المتكون بواسطة الثاقب الفليني Cork borer ثم تثبيتها على سطح الآجار وبعد ذلك يتم التحضين ثم أخذ النتائج