صبغ الغلاف الكبسولة في البكتيريا , Capsule staining

تـمـهـيد :

يعد الغلاف ( الكبسولة أو العلبة ) من الأجزاء التركيبية للبكتيريا بحيث يحيط بجدار الخلية من الخارج منطقة هلامية لزجة يطلق عليها إسم الغلاف في بعض أنواع البكتيريا المغلفة تساعدها على الإلتصاق بالأسطح المختلفة كما أن لها دور مهم في الدفاع عن الخلية ضد أجهزة الدفاع المختلفة داخل جسم العائل وبهذا تعد البكتيريا المحتوية على الغلاف من الأنواع الممرضة ويختلف سماكة هذا الغلاف من نوع لآخر , وفي معظم الحالات تتركب مادة الغلاف من مواد عديدة التسكر Polysaccharides .
ومن المعروف أن طبقة الغلاف هذه يصعب صبغها بالطرق العادية , ولذا يفضل استعمال طرق خاصة لصبغها ومنها .

أولاً: طريقة انتوني Anthony :

المواد والأدوات اللازمة :
مزرعة حديثة من البكتيريا Klebsiella aerogenes – شرائح – إبرة تلقيح ذات العقدة – محلول مائي من صبغة الكريستال البنفسجي – محلول كبريتات النحاس 20% – ماء مقطر – حوض صباغة .

خطوات العمل :
1- حضر غشاء بكتيري من البكتيريا Klebsiella aerogenes واتركه يجف في الهواء دون استعمال الحرارة .
2- أصبغ الغشاء بمحلول مائي لصبغة الكريستال البنفسجي لمدة 2 دقيقة .
3- تخلص من محلول الصبغة ثم اغسل الغشاء بمحلول كبريتات النحاس 20% دون استعمال الماء .
4- أترك الشريحة لتجف مرة ثانية في الهواء جفافاً تاماً .
5- ضع قطرة من زيت السيدر على الغشاء ثم افحص تحت المجهر وسجل التيجة ملاحظاً أن الخلايا تظهر بلون أزرق غامق والغلاف كهالة زرقاء باهتة .

ثانيا : طريقة صبغة أحمر الكونغو Congo red :

المواد والأدوات اللازمة :
المزرعة البكتيرية من الطريقة السابقة – شرائح – صبغة أحمرالكونغو- خليط كحول وحمض – صبغة فوكسين حامضي .

خطوات العمل :
1- حضر غشاء سميك من البكتيريا Klebsiella aerogenes في نقطة من أحمر الكونغو .
2- اترك الغشاء يجف في الهواء دون استخدام اللهب .
3- ثبت الغشاء بواسطة خليط الكحول والحمض لمدة 15 ثانية .
4- اغسل بالماء المقطر ثم غط الغشاء بالفوكسين الحامضي لمدة دقيقة واحدة .
5- اغسل بالماء المقطر وجفف ثم افحص الشريحة تحت المجهر وسجل النتائج ملاحظاً أن الخلايا البكتيرية مصبوغة باللون الأحمر أما الغلاف فيظهر شفافاً عديم اللون والمنظر الخلفي يأخذ اللون الأزرق الداكن .

ثالثا: طريقة صبغة النجروسين Nigrosin stain :

المواد والأدوات اللازمة :
مزرعة مرق الجلوكوز عمرها 24 ساعة لبكتيريا Enterobacter aerogenes – Staphylococcus aureus – صبغة نجروسين – صبغة السفرانين – شرائح – إبرة تلقيح ذات العقدة .

خطوات العمل :
1- خذ شريحة وضع عليها قطرة من النجروسين على أحد طرفيها .
2- خذ مسحة من المزرعة البكتيرية بإبرة التلقيح واخلطها جيداً داخل قطرة الصبغة .
3- خذ شريحة أخرى وضعها على الشريحة الأولى بحيث تلامس الصبغة بزاوية 45 ْ ثم افرد القطرة على الشريحة بسحب الشريحة الثانية إلى الطرف الآخر للشريحة الأولى ليتكون غشاءاً رقيقاً .
4- اترك الغشاء ليجف في الهواء .
5- اغمر الغشاء البكتيري بالسفرانين لمدة 30 ثانية .
6- إسكب الصبغة في حوض الغسيل ثم اغسل الغشاء بالماء المقطر بحذر شديد حتى لا يزال الغشاء .
7- اترك الشريحة حتى تجف ثم افحص الشريحة تحت المجهر ثم سجل النتائج .
يلاحظ ظهور الخلايا باللون الأحمر ويظهر الغلاف شفافاً على خلفية سوداء .

رابعاً : صبغة كنيجا kniga :
هي صبغة تتكون من 10 مل من كحول إيثيلي 95 % مذاب بها 1 جم من الكريستال البنفسجي و 5 جم من بلورات الفينول ثم يرج المخلوط لمدة ساعة على فترات حتى الذوبان ثم يضاف 100 مل من الماء المقطر ويرج جيداً .

خطوات العمل :
1- ضع قطرة من مزرعة بكتيرية سائلة عمرها 24 ساعة .
2- أضف إليها قطرة من الدم ثم اخلطها جيداً ثم افردها واتركها تجف في هواء المعمل ثم يثبت الغشاء بغمره في الميثانول لمدة 5 دقائق .
3- اترك الميثانول يجف في هواء المعمل ثم اغمر الغشاء بصبغة كينجا لمدة دقيقة واحدة .
4- اغسل بالماء ثم جفف في هواء المعمل ثم افحص تحت المجهر .
5- لاحظ أن الخلية البكتيرية ملونة باللون البنفسجي الداكن أمل الكبسولة فتكون ملونة باللون البنفسجي الخفيف .