صبغ الجراثيم , Spore staining

تـمـهـيد :

تهدف هذه التجربة إلى التعرف على بعض التراكيب في البكتيريا من خلال الصبغ حيث أن بعض الصبغات تستخدم لصبغ التراكيب البكتيرية لتوضيحها مثل الأسواط والأهداب وجدار الخلية و الكبسولة والجراثيم وغيرها .
والجراثيم الداخلية للبكتيريا Endospores تتكون عند تعرض الخلية البكتيرية للظروف البيئية السيئة , بحيث ينحصر البروتوبلازم عند جدار الخلية باتجاه النواة , مكوناً جداراً صلباً يتحمل الظروف القاسية كالحرارة المرتفعة والتعرض للكيماويات القاتلة لتحافظ به البكتيريا على النوع , ومن المعلوم أن هذه الجراثيم تبقى لفترات طويلة حتى تتحسن الظروف وتعيد نشاطها من جديد . مثل جنس باسيلاس Bacillus , والجنس كلوستريديوم Clostridium , وجنس سبوروسارسيناسsporosarsina .
ولا تعد هذه الجراثيم وحدات تكاثرية . وهذه الجراثيم مقاومة بطبيعتها لتقبل الأصباغ ولا يمكن لطرق الصبغ العادية التي تصبغ الخلايا الخضرية للبكتيريا أن تؤدي إلى صبغها , لذلك تستخدم الحرارة لإدخال الصبغة إلى داخل الجرثومة .
وهناك طرق عديدة لصبغ الجراثيم وفيما يلي وصف طريقتين منها :

أولاً: طريقة شافر وفولتون Schaeffer & Fulton:
المواد والأدوات اللازمة:
مزارع بكتيرية متجرثمة – شرائح – إبرة تلقيح ذات العقدة – لهب – حامل – حوض – صبغة أخضر الملاكيت Malachite green 5% مائي – صبغة السفرانين – ماء مقطر – مجهر.

خطوات العمل:
1- نثبت الغشاء البكتيري من مزرعة Bacillus subtilis كما سبق .
2- نغمر الشريحة بصبغة أخضر الملاكيت 5 % ثم نسخن على اللهب حتى حدوث التبخر للصبغة دون أن تغلي الصبغة .
3- نستمر في التسخين مع مراعاة عدم جفاف الصبغة عن الغشاء وإضافة الصبغة كلما بدأت تجف وذلك لمدة 5 – 7 دقائق .
4- نصب الصبغة الزائدة في حوض الصباغة ثم نغسل الشريحة بالماء المقطر جيداً بعد أن تبرد .
5- نغمر الغشاء البكتيري بصبغة السفرانين لمدة دقيقة .
6- نغسل الشريحة بالماء ثم نجففها جيداً .
7- افحص الشريحة بالعدسة الزيتية ثم سجل النتائج .
** تظهر الخلية البكتيرية باللون الأحمر أما الجرثومة فتظهر باللون الأخضر و قد تكون الجرثومة وسطية أو طرفية .
ملاحظة : يمكن صبغ الغشاء البكتيري بدون تسخين باستخدام محلول صبغة أخضر الملاكيت بتركيز 10% بغمر الغشاء بالصبغة لمدة 20 دقيقة .

ثانياً: طريقة دورنر Dorner :

المواد والأدوات اللازمة :
أنبوب اختبار صغير – صبغة كربول الفوكسين – حمام مائي – صبغة النجروسين – شرائح .
خطوات العمل :
1- حضر معلق كثيف من خلايا البكتيريا باسيلاس سابتيلاس Bacillus sabtilis في بضع قطرات من الماء في أنبوبة اختبار صغيرة .
2- أضف كمية مماثلة من صبغة كربول الفوكسين المرشح حديثاً إلى معلق البكتيريا .
3- ضع المخلوط في حمام مائي عند 100 ْم لمدة 10 دقائق .
4- اخلط قطرة صغيرة من الخلايا المصبوغة مع قطرة صغيرة من محلول النجروسين على شريحة نظيفة ثم تفرد حتى يتكون غشاء رقيق .
5- أترك الغشاء حتى يجف ويفضل أن يجف سريعاً وذلك بتعريض الشريحة للهواء الساخن فوق اللهب .
6- إفحص الشريحة تحت المجهر ولاحظ ظهور الجراثيم بلون أحمر أما الخلية الخضرية تظهر شفافة في وسط رمادي أو أسود .