دراسة العوامل البيئية المؤثرة على نمو الكائنات الحية الدقيقة , الجزء الأول

دراسة العوامل البيئية المؤثرة على نمو الكائنات الحية الدقيقة
Studying of effective environmental factors on microbial growth

هناك العديد من العوامل المؤثرة في نمو الكائنات الحية الدقيقة وقد تكون هذه العوامل عوامل فيزيائية مثل الحرارة والضغط العالي أو عوامل كيميائية مثل الحاجة للغذاء والإستجابة لأثر السموم أو عوامل حيوية وهو تأثير الكائنات المحيطة أو ما تسمى بالعوامل البيئية Environmental influences . والتي يمكن من خلالها التحكم في نمو هذه الكائنات ويمكن أيضاً أن تؤثر بطبيعة معيشتها والتي يمكن أن تقتل هذه الكائنات .
ويوجد لكل نوع ميكروبي مجموعة من الظروف المثلى إلا أنها تختلف عن بقية الكائنات الحية بقدرتها على مقاومة الظروف بشكل أكبر وذلك لأن الخلية البكتيرية تكتسب الحرارة من الوسط المحيط بها أما استجابتها للتعرض للبرودة الشديدة أو الجفاف الشديد فتظهر فقط في توقف النشاط الإنزيمي دون الموت للخلايا على عكس صور الحياة الأخرى .
ومما هو جدير بالذكر أن معظم صور الحياة تشترك في نفس الظروف البيئية العادية إلا أن هناك شواذ لهذه القاعدة وخاصة في عالم الميكروبات .
وهذه العوامل قد يتداخل تأثيرها بدرجة يصعب معها تحديد طبيعة العامل المؤثرعلى الكائن الدقيق . ويمكن أن نستخدم هذه العوامل البيئية من خلال التحكم بها في حفظ المواد من خلال التأثير على النمو الميكروبي .
وفيما يلي دراسة هذه العوامل البيئية المؤثرة على النمو للكائن الحي الدقيق :

أولاً : العوامل الفيزيائية :
و تشمل الحرارة و الإشعاع و الضغط الأسموزي و الجفاف و تركيز أيون الهيدروجين والتوتر السطحي و التهوية .

1- تأثير الحرارة على النمو Effect of temperature on groth :
تعتبر درجة الحرارة من أهم العوامل المؤثرة على النمو الميكروبي والنشاط الإنزيمي , فمن المعروف أن البكتيريا تختلف في متطلباتها من الحرارة فلكل نوع درجة حرارة مثلى Optimum وهي الدرجة التي يكون عندها النمو والنشاط الإنزيمي أكبر ما يمكن , ودرجة حرارة دنيا Minimum وهي أقل درجة يمكن للميكروب أن ينمو ويتكاثر عندها وأي انخفاض عن هذه الدرجة يؤدي إلى وقف النمو للكائن الدقيق. وأيضا درجة حرارة عظمى Maximum وهي أقصى درجة يمكن للكائن أن ينمو عندها وإذا زادت عن ذلك يؤدي إلى توقف النمو كلية .
وترتبط درجة الحرارة المثلى بدرجة حرارة الوسط الطبيعي لنمو الكائن الدقيق .
ويعتبر التأثير الفعلي للحرارة على الكائنات الدقيقة بتأثيرها على النشاط الإنزيمي في الخلية فبانخفاض الحرارة ينخفض النشاط الإنزيمي مما يؤدي إلى انخفاض معدل النمو وعند وصول درجة الحرارة للتجمد يتوقف النشاط الإنزيمي تماماً فيتوقف النشاط الأيضي تبعاً لذلك وكذلك لعدم قدرة الخلايا على الحصول على الماء .
أما عند ارتفاع درجة الحرارة عن الدرجة المثلى فيزداد النشاط الأيضي إلا أن ارتفاع الحرارة يؤدي أيضاً إلى زيادة معدل تحطيم الإنزيمات والبروتينات وبالتالي الإضرار بالخلايا وموتها . وتعد هذه الدرجات الثلاث من التقديرات المهمة لتصنيف وتعريف كل نوع من الكائنات الدقيقة إذ عن طريقها يمكن تقسيمها إلى ثلاث مجاميع :
بكتيريا محبة للحرارة المتوسطة Mesophilic والبكتيريا المحبة للحرارة المرتفعة Thermophilic والمحبة للحرارة المنخفضة Psycrophilic .

أ- تأثير الحرارة على النمو و تقدير درجة الحرارة المثلى لبعض أنواع من البكتيريا :
خطوات العمل :
1- لقح أربعة أنابيب آجار مغذي مائل بكميات متساوية من مزرعة بكتيريا E.coli نامية في بيئة المرق المغذي بعمر 24 ساعة .
2- لقح أربعة أنابيب أخرى متساوية من مزرعة البكتيريا Bacillus subtilis بنفس العمر .
3- لقح أربعة أنابيب أخرى من مزرعة البكتيريا Pseudomonas بنفس العمر.
4- قسم الأنابيب جميعها إلى أربعة مجاميع كل مجموعة تحتوي على ثلاثة أنابيب .
5- ضع مجموعة في حضان عند 55 ْم ومجموعة أخرى عند 37 ْم وأخرى في درجة حرارة الغرفة والأخيرة عند 5 ْم وذلك لمدة 48 ساعة ولمدة أسبوع . ويتم ملاحظة النمو
6- افحص الأنابيب في كل مجموعة ولاحظ النمو وقدر كميته .
7- سجل النتائج في جدول للمقارنة بين الأنواع المختلفة من البكتيريا من حيث تأثير درجات الحرارة المختلفة على كل نوع وكذلك معرفة درجة الحرارة المثلى لكل نوع من أنواع البكتيريا الثلاثة السابقة .
** يمكن اجراء نفس الخطوات لدراسة تأثير درجة الحرارة على الفطريات وتحديد درجة الحرارة المثلى .

أ‌- تقدير درجة الحرارة القاتلة لخلايا البكتيريا Lethal effect of temperature :
يلزم في بعض الأحيان تحديد درجة الحرارة المرتفعة التي تقتل خلايا نوع معين من البكتيريا عند تعريضها للحرارة لمدة 10 دقائق وتعرف هذه الدرجة بدرجة الحرارة المميتة Thermal death point . أو يمكن تقدير الوقت اللازم لقتل الخلايا البكتيرية عند تعريضها لدرجة معينة من الحرارة المرتفعة وتسمى بالوقت الحراري المميت Thermal death time .
ونلاحظ أنه يمكن تداخل هذه التقديرات مع عوامل أخرى تؤثر فيها مثل الرقم الهيدروجيني والضغط و كثافة المعلق البكتيري وغيرها .
وتعد هذه الطرق غير دقيقة تماماً نظراً لأنه لاتقتل جميع الخلايا في نفس الوقت عند درجة الحرارة المستعملة أو عند تعريضها لفترة معينة عند درجة حرارة ثابتة .
وتهدف مثل هذه الدراسات إلى تحديد أفضل درجة حرارة وأقل زمن ممكن للتخلص من الخلايا الضارة مع الأخذ بعين الإعتبار عدم تأثر بعض المواد المعاملة حرارياً وخاصة المفيدة للإنسان بحيث تحافظ على مفعولها أو قيمتها مثل البروتينات التي تتكسر عند درجات الحرارة العالية .

خطوات العمل :
1- ضع 1 مل من مزرعة البكتيريا E.coli بعمر 24 ساعة في كل من 5 أنابيب معقمة وفارغة .
2- جهز حمام مائي عند 45 ْم ثم ضع به أحد الأنابيب لمدة 10 دقائق ثم صب محتوياته في طبق بتري معقم .
3- ارفع درجة الحمام المائي عند 50 , 55 , 60 ْم وضع الأنابيب الأخرى بالتوالي كل على حدة وذلك كما في الخطوة السابقة .
4- فرغ محتويات الأنبوبة الخامسة في طبق بتري معقم دون تعريضها للمعاملة الحرارية بغرض المقارنة .
5- خذ كمية من الآجار المغذي المعقمة والمسال عند 45 ْم ثم صب كميات متساوية من الآجار في أطباق بتري ثم أضف كمية من العينة إليها واخلطها جيداً في الأطباق .
6- حضن الأطباق عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
7- دون النتائج في جدول ثم قارن عدد المستعمرات للتعرف على درجة الحرارة العظمى المناسبة لقتل البكتيريا المستخدمة في التجربة .
ملاحظة : يمكن تكرار هذه التجربة على أنواع مختلفة من البكتيريا للتعرف على اختلاف تأثير الحرارة على الأنواع المختلفة وكذلك تحديد درجة الحرارة المميتة لكل نوع .

تقدير الزمن اللازم لقتل الخلايا البكتيرية عند درجة حرارة مرتفعة معينة ( الوقت الحراري المميت ) لنوع من البكتيريا :
1- ضع 1 مل من مزرعة البكتيريا E.coli بعمر 24 ساعة في كل من 5 أنابيب معقمة وفارغة .
2- جهز حمام مائي عند 60 ْم مثلاً ثم ضع الأنابيب الخمسة في الحمام المائي لمدة 5 – 10 – 15 – 20 – 25 دقيقة بالتتابع .
3- صب كل أنبوب في طبق بتري معقم ثم أضف عليه الآجار المغذي واخلطه مع العينة واتركه حتى التصلب .
4- حضن الأطباق عند 37 ْم لمدة 24 ساعة ثم تؤخذ النتائج لتحديد الوقت اللازم لقتل الخلايا البكتيرية عند 60 ْم .
يمكن إعادة هذه التجربة لتحديد الوقت اللازم لقتل الخلايا البكتيرية عند درجات حرارة مختلفة وكذلك لدراسة الوقت اللازم لقتل خلايا أنواع أخرى من البكتيريا عند درجات مختلفة . كما يمكن استخدام هذه الدراسة لمعرفة الوقت اللازم لقتل خلايا وجراثيم الفطريات .

مقاومة الميكروبات للحرارة Heat resistance of microbes
1- حضر أنبوبتين من مزارع سائلة لكل من Bacillus cereus , E.coli , Aspergillus niger , Saccharomyces cerevisiae .
2- حضن أنبوبة من كل نوع عند 80 ْم لمدة 10 دقائق وبعد ذلك برد الأنابيب بسرعة بالماء البارد , واترك الأنبوبة الثانية من كل نوع بدون تعريض للحرارة .
3- اترك الأنابيب جميعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 – 6 أيام .
4- لقح أنابيب محتوية على بيئة آجار الجلوكوز المائلة ثم حضن الأنابيب عند درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام ثم لاحظ النمو بعد انقضاء فترة التحضين .
5- جهز شريحتين من كل أنبوبة واصبغ أحداهما بصبغة جرام والأخرى بصبغة الجراثيم .
نلاحظ أن بعض الميكروبات المستخدمة قتلت بفعل الحرارة العالية أما الأنابيب التي لم تتعرض للحرارة العالية بقيت الخلايا فيه حية , وبعض هذه الكائنات قد تكون لها جراثيم وذلك لتحافظ على حيويتها ولتستطيع مقاومة الحرارة العالية .

تأثير الإشعاع :
بعض الإشعاعات مثل الأشعة فوق البنفسجية والأشعة السينية وأشعة جاما وغيرها ذات تأثير قاتل للبكتيريا من خلال التردد القصير للأشعة الذي يؤثر على النشاط الحيوي للخلية وهذه الإشعاعات من أهم الإشعاعات المستخدمة في الدراسات المعملية .
فالأشعة فوق البنفسجية ليست سامة فقط للخلايا البكتيرية بل إنها أيضاً تعمل على تكوين مواد سامة لخلايا البكتيريا داخل بيئات الزرع سواءاً كانت ملقحة أو غير ملقحة .

خطوات العمل :
1- لقح أنبوبتين من الاجار المغذي المسال والمبرد عند 45 ْم إحداها ببكتيريا E.coli بعمر 24 ساعة والأخرى ببكتيريا Bacillus subtillus بعمر 72 ساعة ثم اخلط اللقاح جيداً بالآجار في كل أنبوبة .
2- صب محتويات كل أنبوبة في طبق بتري واتركها لتتصلب .
3- احضر قطعتين من ورق أسود أو ورق قصدير واقطع بها شكلاً معيناً .
4- غط الطبقين بالورق المثقب ثم عرضهما لمصدر للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 – 10 دقائق .
5- بعد وقت التعريض ارفع الورق الأسود المثقب وغط الأطباق بورق سليم ثم حضن الأطباق بالحضان عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
6- قارن بين عدد المستعمرات للمناطق التي تعرضت للأشعة وبين المناطق التي لم تتعرض للأشعة وسجل ملاحظاتك .
ملاحظة : يمكن تعريض طبقين غير ملقحين للأشعة وذلك بعد تغطيتهما بالورق الأسود بعد عمل أشكال معينة وذلك للتعرف على تأثير الأشعة فوق البنفسجية على البيئة نفسها في المناطق المعرضة للأشعة ثم القيام بزرع البكتيريا على الأطباق بعد فترة التعريض.

3- دراسة تأثير تغير المكان Effect of place:
من المعروف أن الكائنات الدقيقة منتشرة في كل مكان حولنا إلا أن توزيعها يختلف من بيئة لأخرى وذلك تبعاً لاختلاف الظروف البيئية من مكان لآخر .
ولمعرفة الأنواع الميكروبية الموجودة في مكان ما والتأكد من اختلاف هذه الأنواع تبعاً لاختلاف المكان نقوم بإجراء تجربة بسيطة على سبيل المثال مع ملاحظة استخدام البيئات المناسبة لنمو كل نوع من الكائنات وكذلك تغيير الظروف البيئية مثل التحضين ودرجة الحموضة وغيرها في كل مرة للحصول على معظم الأنواع الموجودة في مكان ما .

خطوات العمل :

1- نأخذ مجموعتين من الأطباق كل مجموعة مكونة من خمسة أطباق محتوية على الآجار المغذي و مجموعتين أخريين مكونة من خمسة أطباق محتوية على بيئة تشابكس دوكس آجار ونعرضها للهواء الجوي لمدة 10 دقائق في أماكن مختلفة مثل المعمل والفناء الخارجي أوالصوبة الزراعية (أو أي مكان زراعي) على سبيل المثال.
2- نقوم بتحضين هذه الأطباق في درجة حرارة 20 ْم , 33 ْم , 40 ْم وكذلك توفير جو خال من الأكسجين والطبق الأخير نعمل على زيادة نسبة الملح مثلاً وذلك لمدة 24-48 ساعة للبكتيريا و4-5 أيام للفطريات .
3- بعد فترة التحضين نقوم بدراسة أنواع الكائنات النامية في الأطباق لمعرفة مدى اختلافها من مكان لآخر .

4- دراسة تأثير فترة التعريضexposition time Effect of :
إن الزيادة في فترة تعرض المواد للهواء الجوي يعطي فرصة أكبر لوصول عدد أكبر من الكائنات الدقيقة لهذه المواد وبالتالي زيادة تاثير هذه الكائنات على المواد . ولدراسة هذه الظاهرة نقوم بالتجربة التالية :

خطوات العمل :

1- نأخذ ثلاثة أطباق محتوية على الآجار المغذي وثلاثة أطباق محتوية على بيئة تشابكس دوكس آجار ونعرضها للهواء الجوي في مكان معين لفترات زمنية مختلفة 10 – 20 – 30 دقيقة .
2- نقوم بتحضين هذه الأطباق في درجة حرارة 33 ْم ولمدة 24-48 ساعة للبكتيريا و4-5 أيام للفطريات . ثم نقارن بعد فترة التحضين للتعرف على مدى التلوث الناتج في الأطباق نتيجة زيادة فترة التعريض .

5- تأثير الضغط الأسموزي على النمو Effect of osmotic pressure on growth :
لكل من الخلايا الميكروبية والوسط الغذائي المحيط بها تركيز أسموزي منفصل يعتمد على المواد المكونة لكل منهما وعند وضع الخلية البكتيرية في بيئة ما تتأثر بالضغط الأسموزي لهذا الوسط ومما هو معروف أن الميكروب يستطيع النمو بشكل جيد في وسط يكون الضغط الأسموزي له أقل بقليل من تركيز الخلية نفسها مما يساعد على انتقال الماء داخل الخلية وبالتالي انتقال الغذاء إليها . وعندما يكون تركيز الوسط أقل بكثير من التركيز داخل الخلية يؤدي ذلك لانتقال الماء بكميات كبيرة داخل الخلية مما يؤدي لانتفاخ الخلية الميكروبية وبالتالي انفجارها وتسمى هذه الظاهرة الإنتفاخ الأسموزي Plasmoptysis , وعندما يكون الضغط الأسموزي للوسط أعلى من الضغط الأسموزي داخل الخلية يؤدي ذلك لخروج الماء من الخلية إلى الوسط المحيط وبالتالي انكماش الغشاء البلازمي عن الجدار الخلوي وتسمى هذه الظاهرة الإنكماش الأسموزي Plasmolysis .
وتتميز معظم الكائنات الدقيقة بنموها في أوساط متعادلة أسموزياً إلا أنه توجد أنواع لها القدرة على تحمل الأوساط الأسموزية العالية بل بعضها لا ينمو إلا في الأوساط ذات التركيزات العالية ويطلق على الكائنات التي تعيش في اوساط ملحية ولكنها ليست بيئتها الأصلية بمتحملة الملوحة salt tolerant والتي تعيش في أوساط عالية الملوحة بمحبة الملوحة halophilic وبعض الكائنات لاتنمو إلا في أوساط ذات تركيزات ضئيلة من الملح وتسمى كارهة الملوحة .
ويكمن تأثير الضغط الأسموزي بأنه عامل مجفف له أهمية كبرى في علم الأغذية بحيث تستخدم هذه الظاهرة في حفظ الكثير من الأغذية مثل المربيات والمخللات والحليب المكثف والأغذية المملحة كالأجبان واللحوم والأسماك ولا يعني ذلك أن هذه الطريقة معقمة للغذاء ولكن تعمل على وقف النشاط الحيوي للميكروبات بحيث لو انخفض الضغط الأسموزي لعاودت الميكروبات نشاطها الحيوي ونمت من جديد .
ولدراسة هذه الظاهرة يمكن اتباع إحدى الطرق التالية :

الطريقة الأولى :
خطوات العمل :
1- حضر أربعة أنابيب من آجار الجلوكوز العميق محتوية على تركيزات مختلفة من ملح كلوريد الصوديوم 0.5 – 5 – 15 – 25 % , وأربعة أنابيب أخرى محتوية على تركيزات مختلفة من السكروز 0.5 – 15- 30 – 60 % وصب كل أنبوب منها في طبق بتري .
2- قسم كل طبق من الخلف باستخدام قلم شمع إلى أربعة أقسام ولقح كل قسم بنوع من أنواع الميكروبية التالية E.coli , Staphylococcus , Saccharomyces , Penicillium على مساحة 1 سم2 في كل قسم لضمان عدم تداخل المستعمرات مع ملاحظة كتابة المعلومات اللازمة على الطبق .
3- حضن الأطباق على درجة حرارة 30 ْم لمدة أربعة أيام ثم سجل النتائج التي تحصل عليها ملاحظاً أي الأنواع الأربعة متحملة للأسموزية العالية بالنسبة للملح أو السكر وكذلك تحديد التركيز الملحي أو السكري المناسب لكل نوع .
ملاحظة :
يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تأثير تركيز السكريات المختلفة على الكائنات الدقيقة بتغيير تركيزات السكريات لمعرفة تأثر النمو والتكاثر للكائنات الدقيقة وكذلك معرفة التركيز المناسب عند الحاجة لإنتاج مادة ما من الكائنات الدقيقة للحصول على أكبر كمية ممكنة .
الطريقة الثانية :
خطوات العمل :
1- جهز أنبوبتين بهما محلول سكر السكروز 20 % و أنبوبتين بتركيز 5 % وأنبوبتين أخريين بهما محلول سكروز 0.5 % .
2- كرر الخطوة رقم ( 1 ) ولكن باستعمال محلول كلوريد الصوديوم 15 % و 3 % و 0.3 % .
3- صب في ستة أطباق بتري بيئة آجار مغذي مسال ثم اتركه يتصلب .
4- قسم قاعدة كل طبق إلى ستة أقسام بقلم تخطيط .
5- قسم الأنابيب السابقة إلى مجموعتين بحيث تلقح المجموعة الأولى ببكتيريا E.coli والمجموعة الثانية ببكتيريا Bacillus subtilis .
6- لقح كل قسم من أقسام أحد الأطباق مباشرة بعد الخلط بالتراكيز السابقة لأحد أنواع البكتيريا ولقح طبق آخر بالتراكيز المختلفة للنوع البكتيري الآخر .
7- بعد مرور ساعة من وجود البكتيريا في المحاليل كرر الخطوة رقم ( 6 ) .
8- بعد مرور 24 ساعة من وجود البكتيريا في المحاليل كرر الخطوة رقم ( 6 ) .
9- بعد التحضين للأطباق لمدة 24 ساعة دون النتائج بالنسبة للمحاليل السكرية والملحية كل على حدى . ملاحظاً النمو الأمثل لكلا النوعين من البكتيريا في أي تركيز وكذلك تحديد أي منهما متحملاً للأسموزية العالية .
الطريقة الثالثة :
1- حضر أربعة أنابيب من مرق الجلوكوز محتوية على تركيزات مختلفة من ملح كلوريد الصوديوم 0.5 – 5 – 15 – 25 % , وأربعة أنابيب أخرى محتوية على تركيزات مختلفة من السكروز 0.5 – 15- 30 – 60 % .
2- لقح كل أنبوبة من أنابيب المرق المحتوية على الملح بقطعة من الهامبرجر الخام ولقح كل من الأنابيب المحتوية على السكروز بقطعة من الفاكهة المجففة مثل الزبيب أو التين .
3- حضن الأنابيب عند 30 ْم لمدة يومين ولاحظ النمو ثم استمر بالتحضين حتى سبعة أيام وخذ النتائج .