تجارب , اختبارات الاحياء الدقيقة الطبية

من المهم جداً أن نذكر أهمية أي دراسة في مجال العلوم ارتباطها بالحياة وما يتعلق بالإنسان من جميع النواحي وهنا لا نغفل ناحية مهمة تتعلق بصحة الإنسان وسلامته كما درسنا سابقاً بعض الأمور التي تتعلق بالنواحي الغذائية وسلامتها لكي يتمكن الإنسان من حماية نفسه من الأمراض وكذلك حماية ما ينتج غذاءه من الأمراض التي تسببها الكائنات الحية الدقيقة .
لذا كان من المهم أن نذكر هنا كيفية الفحص الطبي الذي يمكننا من معرفة هل الإصابة التي حصلت له عرضية أم بسبب الكائنات الممرضة .
ونتيجة للتطور الكبير في مجالات العلوم أدى ذلك لظهور علم الأحياء الدقيقة التشخيصية والذي ساعد هذا التطور في انتشاره واتساعه خدمة للإنسان .
وقد ذكرنا من خلال هذا الجزء من الكتاب والمتعلق ببعض التطبيقات المخبرية في علم الأحياء الدقيقة بعضاً من التجارب المتعلقة بالفحص المخبري للكائن من حيث طرق العزل ودراسة الكائن الذي تم عزله وكذلك قمنا بذكر بعض الدراسات التي تساعدنا على التعرف على هذا الكائن من حيث الدراسة المورفولوجية والدراسة الفسيولوجية , وسنقوم في هذا الجزء إن شاء الله بالتعرف على كيفية عزل الكائن الدقيق من الجسم من عدة مناطق وكيفية الحصول على العينات والتعامل معها وكذلك ذكر أهم الفحوصات التي يتم من خلالها التعرف على نوع الكائن المسبب للمرض .
وأخيراً أرجو من الله العون والتوفيق .

ملاحظة هامة :
1- راجع الإختبارات الكيموحيوية في الجزء الخاص بالتطبيقات الفسيولوجية على الكائنات الحية الدقيقة .
http://www.tafawk.com/vb/forumdisplay.php?f=74
2- راجع خواص البيئات في الجزء المخصص لذلك في نهاية جزء البكتيريا الطبية .
3- راجع الصفات الخاصة بالبكتيريا ( الشكلية والمزرعية والفسيولوجية ) في نهاية جزء البكتيريا الطبية .

ومن الجدير بالذكر أن مرحلة التشخيص المخبري laboratory diagnosis تمر بعدة خطوات متسلسلة يعطي كل منها دليلاً معيناً على وجود الكائن وهذه الخطوات هي :
1- التعرف على شكل الكائن الحي الدقيق وصفاته التركيبية .
2- التعرف على شكل النمو على المزرعة وصفات هذا النمو كما سبق ذكره .
3- التفاعلات البيوكيميائية والمصلية .

وتمر عملية الفحص المخبري للكائنات الممرضة بأربعة مراحل هامة وهي :
أ – الفحص المجهري للعينة الممرضة microscopic examination of patient speciment :
حيث تعطي هذه المرحلة معلومات مهمة خلال فترة قصيرة من وصول العينة للمختبر وذلك للتعرف على شكل الكائن وبعض صفاته , ومن الطرق المستخدمة في هذا المجال :

1- الفحص المباشر للعينة direct examination :

ويتم بعدة طرق منها الفحص بطريقة التحضير الرطب wet mount لمشاهدة الكائن وبعض الدلائل الأخرى التي تشير إلى الإلتهاب مثل الخلايا القيحية bus cells وكمية خلايا الدم الحمراء الموجودة في العينة في بعض الحالات .
كما يمكن استخدام طريقة النقطة المعلقة hanging drop technique للتعرف على البكتيريا المتحركة وغير المتحركة .

2- عمليات الصبغ staining :

استخدام هذه الطريقة بتحضير شرائح للعينة الممرضة بالطريقة المناسبة بحسب العينة ثم القيام بعملية الصبغ بالطريقة المناسبة وحسب ما يلزم للتعرف على الكائن المسبب للمرض كما ذكرنا سابقاً لأهم طرق الصبغ المتبعة في الفحوص الميكروبية سنذكر بعضها الآخر في حينه إن شاء الله .
وتعتبر هذه الطريقة مهمة للأسباب التالية :
1- التعرف على شكل الكائن الدقيق .
2- التعرف على الكائن الحي الدقيق .
3- التعرف على تفاعله مع صبغة جرام .

3- فحوصات الحقل المظلم dark field examination :

تستخدم هذه الطريقة بشكل خاص للتعرف على اللولبيات spirochetes باستخدام مجهر الحقل المظلم بحيث يسلط الضوء على العينة بشكل مائل فيرى الضوء المنعكس عن العينة فيظهر العينة وما حولها معتم دون أن ينفذ الضوء من خلال العينة .

4- الفحص التألقي المناعي المباشر direct immunofluorescence assay :

تستخدم بخاصة للكشف عن الأنواع البكتيرية التالية
Legionella pneumophila , Bordetella pertussis في عينة الجهاز التنفسي
Chlamydia trachomitis في تجويف العين والجهاز التناسلي , وتستخدم للكشف عن الفيروسات المختلفة .
وتتم هذه الطريقة بلصق أصباغ مشعة مثل الفلورسين مع أجسام مضادة دون أن تؤثر على التصاقها بالأنتيجينات , وعند اتصاق جسم مضاد معالج بالفلورسين وخاص بأنتيجين معين على سطح الجرثومة بحيث يظهر سطح الجرثومة مشعاً عند ارتباط الجسم المضاد به وذلك عند استخدام مجهر خاص يعمل بالأشعة فوق البنفسجبة بدلاً من الضوء العادي .
وبهذه الطريقة يمكن تحديد الأنواع المصلية serotypes المختلفة للميكروبات عند الفحص المباشر للعينة .

ب- الكشف عن جزيئات خاصة بالكائن الدقيق detection of pathogen-specific macromolecules :
و تتميز هذه الطرق بالسرعة والدقة والسهولة و تشمل الفحوصات التالية :
1- الكشف عن أنتيجينات البكتيريا : وتشمل
< طرق الفحص المناعي الإنزيمي enzyme immunoassay ( EIA ) :
أو ما يعرف بـ ELISA test .
تستخدم في هذه الطريقة أجسام مضادة ملتصقة بسطح صلب مثل الأغشية والأطباق الدقيقة microtiter plate وذلك للإرتباط بالأنتيجين Ag في العينات السائلة إذ أنه بعد ارتباط النتيجين بالأجسام المضادة والمحضرة يتم إضافة أجسام مضادة أخرى متخصصة معلمة بالإنزيمات Enzyme-labeled antibody إلى المزيج ثم يتم إضافة المادة الأساس ( مادة التفاعل ) substrate الخاصة بالإنزيم لإعطاء تفاعل مرئي نتيجة لذلك مما يمكن الفاحص من رؤية هذا التفاعل على أجهزة خاصة .
وعند التفاعل إذا كان الجسم المضاد المعلم خاص بالأنتيجين المضاف فإنهما يرتبطان ببعضهما دون أن يزالا بعمليات الغسل المتكررة فتكون النتيجة إيجابية , أما إذا أزيلا عن بعضهما بالغسل فتكون النتيجة سلبية .
وباستخدام هذه الطريقة يمكن الكشف عن العديد من الميكروبات الممرضة مثل :
بكتيريا Streptococcus pharyngitis في مسحة مأخوذة من الحلق , وكذلك يمكن الكشف عن بكتيريا Chlamydia trachomitis وسموم بكتيريا Clostridium difficile والعديد من الفيروسات .
ويمكن الحصول على نتائج سريعة خلال 10 دقائق إلى ثلاث ساعات بحسب العينة وبدقة عالية تصل إلى 95 % باستخدام هذه التقنية .
ويمكن أن نستخدم تقنية الـ ELISA في الفحوصات التالية :

أ- الكشف المباشر عن الأنتيجينات :
– إضافة العينة ( مصل الدم ) إلى أجسام مضادة خاصة ملتصقة بسطح صلب .
– إضافة أجسام مضادة معلمة بالإنزيمات متخصصة بالأنتيجين المراد الكشف عنه .
– إضافة المادة الأساس لينتج التفاعل اللوني .

ب- الكشف عن الأجسام المضادة ( IgM ) :
– أجسام مضادة خاصة بالنوع IgM ملتصقة بسطح صلب .
– إضافة العينة المحتوية على IgM .
– إضافة الأنتيجينات الخاصة بهذا الجسم المضاد .
– إضافة أجسام مضادة معلمة بالإنزيمات متخصصة بالأنتيجين المراد الكشف عنه .
– إضافة المادة الأساس لينتج التفاعل اللوني .

http://virology-online.com/general/ELISA.jpg

فحص ELISA

< طريقة التخثر Particle agglutination :

تتلخص هذه الطريقة بتحضير جزيئات كبيرة تعرف بـ Latex مغطاة بأجسام مضادة خاصة بنوع معين من الأنتيجينات ثم خلطها مع العينة المحتوية على الأنتيجين فإذا كان هذا الأنتيجين متناسباً مع الجسم المضاد المحضر فإن النتيجة الإيجابية تظهر على شكل تخثر على شكل حبيبات والذي يعرف بـ Latex agglutination
http://www.microgenbioproducts.com/images/DCP_4127.JPG
http://www.oxoid.com/image_library/UK/5_6_2007_OXOIDPR296.JPG

2- الكشف عن تسلسل الحامض النووي detection of nucleic acid sequences :
ويتم بعدة طرق منها :
< فحص الإستدلال على الحامض النووي للكائن الدقيق :
تستخدم في الكشف السريع عن البكتيريا التي يصعب عزلها مثل بكتيريا السيلان Neisseria gonorrhoeae و C.trachomatis من العينات المرضية أو المزارع البكتيرية .
وتبنى هذه التقنية على أن أي نوع من الـ DNA يحمل شيفرة لتسلسل معين من الجينات حيث يتم عزل DNA وتحطيمه على شكل خيط منفرد ليستخدم في إنتاج DNA مكمل cDNA (complementary DNA ) الذي يستخدم كدليل probe يتم الكشف من خلاله فيما بعد على rRNA الناسخ في أية عينة تحتوي على نفس الكائن الدقيق الذي أخذ منه الـ DNA الأصلي .
ويستخدم جهاز خاص لهذا الغرض غير أن هذه الطريقة مكلفة من حيث سعر الجهاز المستخدم والمواد اللازمة لإجراء هذا الفحص .

< فحص PCR Polymerase chain reaction :
يستخدم بكثرة في فحص العينات المرضية المحتويةعلى الكائنات الدقيقة بالإعتماد على تكثير DNA الكائن الدقيق الموجود في العينة المرضية لتسهيل إجراء الفحوصات اللازمة على الـ DNA . وتتلخص بما يلي :
1- يتم عمل مزيج من المكونات التالية :
– الـ DNA المراد التعرف عليه .
– جين البدئ primers قادر على الإرتباط بشريط الـ DNA في نقطة معينة .
– أنواع متعددة من النيوكليوتيدات .
– إنزيم بلمرة مقاوم للحرارة Taq polymerase .
إذ أنه من الضروري إضافة جينات البدء والنيوكليوتيدات بكميات كبيرة إلى المزيج .
2- يوضع المزيج في جهاز حراري خاص Thermocycler مجهز لتغيير درجة الحرارة وتنظيم خطوات PCR الثلاث التالية :
– يتم فصل الـ DNA إلى شريط مفرد على درجة حرارة 90–95 ْم.
– يبرد المزيج إلى درجة 50 ْم ليتم السماح لجين البدء بالإرتباط في موقعه المخصص على شريط الـ DNA من أجل البدء في إنتاج سلسلة مكملة لشريط الـ DNA الأصلي المفرد .
– يتم زيادة درجة الحرارة إلى 72 ْم بحيث يبدأ إنزيم البلمرة Taq polymerase بإضافة بإضافة النيوكليوتيدات إلى الجين لتكوين سلسلة DNA مكملة ومقابلة للشريط الأصلي .
3- تكرر هذه العملية عدة مرات لإنتاج ملايين النسخ من DNA الكائن الدقيق المراد تكثيره .
تقرأ السلسلة للكائن بعد ذلك باستخدام جهاز الـ PCR للتعرف على تركيب الحمض النووي للكائن المدروس .

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/da/Pcr_machine.jpg/220px-Pcr_machine.jpg

جهاز PCR

ج – زراعة وعزل الكائن الدقيق Cultural and isolation of microorganism :

تعتبر عملية الزراعة من أهم الطرق المستخدمة لتشخيص الأحياء الدقيقة وذلك عن طريق تكثير الكائن الدقيق الموجود في العينة المرضية ممايسهل دراسة صفات هذا الكائن من حيث الصفات الشكلية للمستعمرات والنمو والتفاعل مع الأجسام المضادة والتفاعلات البيوكيميائية .
ولابد من توفير الظروف الملائمة لنمو الكائن الممرض مثل درجة الحرارة المناسبة وفترة التحضين التي تتناسب مع طبيعة الكائن في سرعة الإنقسام و طريقة التغذية .
ولابد من ذكر أن هناك أوساط مختلفة لتنمية الكائنات الدقيقة فهي تختلف بحسب نوع الكائن إن كان بكتيريا أو فطريات أو فيروسات .

د- الفحوصات المصلية Serological test :

تعتمد هذه الفحوصات على تفاعل الأجسام المضادة Antibody التي كونها الجسم نتيجة الإصابة بجرثومة معينة مع أنتيجينات محضرة في المختبر وخاصة بالجرثومة نفسها .
إذ ترتفع كمية الأجسام المضادة في الجسم بعد الإصابة بالجرثومة وتكون هذه الأجسام المضادة خاصة بالجرثومة المسببة للمرض لذلك فإن الفحوصات المصلية مفيدة للتشخيص المبكر للإصابات الجرثومية . ويكون الإعتماد على الفحوصات المصلية مناسباً في الحالات التالية :
1- صعوبة عزل الكائن المسبب للمرض مثل الإصابات الناجمة عن الفيروسات والمايكوبلازما .
2- عمق مكان الإصابة مثل التهاب الرئة Pneumonia والتهاب الكبد والتهاب السحايا .
3- تحديد مرحلة الإصابة والتمييز بين الإصابة الحالية والقديمة .

ويفضل أخذ عينتين من الدم للمصاب بالمرض الأولى خلال الطور الحاد للمرض Acute phase والأخرى بعد اسبوعين إلى ثلاثة أسابيع للحصول على الدقة العالية في التشخيص .
ومن أهم هذه الفحوصات :
1- فحوصات التخثر Agglutination test : حيث تستخدم في تشخيص الحمى المالطية والتيفوئيد وغيرها .
2- فحص تثبيت المكمل Complement fixation : أكثر ما يستخدم فيه هذا الفحص لتشخيص الإصابات الفطرية والفيروسية وحمى Q ( Q fever ) التي تسببها بكتيريا Coxiella burnetii .

3- الفحوصات التألقية المناعية غير المباشرة Indirect immuno fluorescence test
في هذه الطريقة تستخدم أجسام مضادة مرتبطة بمادة مشعة خاصة بنوع معين من الأجسام المضادة Anti-human antibody التي تتفاعل أصلاً مع الإنتيجينات , وتستخدم هذه الفحوصات في الكشف عن بكتيريا الزهري Treponema وبكتيريا Borrelia والركتسيا وغيرها .