الصبغة المقاومة للأحماض , Ziehl-Neelsen method , The acid fast stain

تمهيـد :
تعتبر هذه الطريقة من طرق الصبغ المركب أيضاً إلا أن الهدف من استعمالها يختلف قليلاً فقد تمكن كل من العالمين زيهل Ziehl ونيلسون Neelsen سنة ( 1883م ) من التوصل إلى طريقة تم بها صبغ البكتيريا المسببة لمرض السل حيث يصعب صبغها بالطرق المعتادة وذلك بعد أبحاث طويلة حيث لم يتم رؤية المسبب قبل ذلك .
وتم التوصل لهذه الطريقة بصبغ بصاق أحد المرضى بالسل بصبغة كاربول فوكسين Carbol fucsin الساخنة . ولاحظا أن الخلايا البكتيرية قد أخذت لون الصبغة واحتفظت بها حتى بعد معاملتها بالكحول الحامضي , كما أنها لم تتلون بصبغة أزرق الميثيلين التي استخدمت كصبغة مضادة بل ظلت حمراء بلون صبغة الكاربول فوكسين في وسط أرضية زرقاء وهو لون صبغة أزرق الميثيلين .
تعتبر هذه الطريقة ذات أهمية كبرى في تشخيص وتحديد الكثير من الكائنات الدقيقة مثل بكتيريا السل Tuberculosis Mycobacterium و بكتيريا الجذام Leprosy إضافة إلى الكشف عن الكثير من المترممات غير الضارة والمقاومة للأحماض مثل الأكتينومايسيتات .
و السبب في حدوث مثل هذه الظاهرة هو احتواء جدر الخلايا المقاومة للأحماض على دهون شمعية تسمى حمض الميكوليك Mycolic acid تجعل جدر الخلايا لا تنفذ معظم الأصباغ .
وتعتمد نظرية الصبغ على استخدام محلول الكربول فوكسين المحتوي على 5٪ فينول حيث أن الفوكسين يذوب في الفينول أكثر من إذابته في الماء , أما الفينول فإنه يذوب في الدهون أكثر من إذابته في الحمض الكحولي لذلك فإن الكربول فوكسين يكون له قابلية للدهون أكثر من قابليته لخليط الحمض والكحول وبالتسخين يمكن تثبيت الصبغات المستخدمة بشكل مناسب ولهذا فإن جدر الخلايا تحتفظ بالصبغة ولا تفقدها أثناء الغسيل .

المواد والأدوات اللازمة :

مزرعة عمرها خمسة أيام من بكتيريا غير ممرضة منماة على بيئة آجار جليسرين مائل – مزرعة من Staphylococcus aureus منماة على بيئة مائلة – صبغة كاربول فوكسين – كحول حامضي – صبغة أزرق الميثيلين .

طريقة العمل :

1- حضر غشاء بكتيري من Mycobacterium smegatis , Staphylococcus aureus .
2- اترك كل من الغشاءين يجف في هواء المعمل ثم ثبت بالحرارة ثم اصبغ كما يلي:
أ- ضع الشريحة على حامل ثلاثي الأرجل ثم اغمر الغشاء بصبغة الكاربول فوكسين ثم حرك اللهب بهدوء على السطح السفلي للشريحة حتى تبدأ تتبخر ولا تتركها حتى
الغليان ولا تجعل الصبغة تجف على الشريحة .
كرر هذه العملية لمدة سبع دقائق مع إضافة الصبغة كلما تطلب ذلك .
* يمكن وضع قطعة من ورق النشاف على الغشاء ثم نغطيه بصبغة الكربول فوكسين ثم نضع الشريحة فوق حمام مائي يغلي ونتركه سبع دقائق دون جعل الصبغة تجف وإضافة الصبغة كلما لزم الأمر .
ب- اترك الشريحة فترة من الزمن لتبرد ثم اغسل الشريحة بتيار مائي خفيف لغسل
الصبغة .
ج- اغسل الصبغة بالكحول الحامضي لمدة دقيقة إلى دقيقتين إلى أن يقف ظهور الصبغة تماماً وتحتاج إلى تغيير الكحول مرتين أو أكثر مع ملاحظة عدم إطالة وقت الغسل.
د- اغسل الغشاء تحت تيار مائي خفيف .
هـ ـ اصبغ الغشاء بصبغة أزرق الميثيلين لمدة دقيقة أو دقيقتين .
و- اغسل الشريحة بالماء ثم جفف الشريحة .
3- افحص تحت العدسة الزيتية وارسم ما تشاهده مع ملاحظة لون الخلايا .
يلاحظ ظهور الخلايا المقاومة للحمض باللون الأحمر أما الخلايا غير المقاومة للأحماض فتظهر باللون الأزرق .