الصبغات التفريقية المركبة , Diffrential or compound staining , صبغة جرام , Gram staining

تمهيـد :

صبغة جرام هي من الصبغات المركبة نظراً لاستعمال أكثر من صبغة , وتعرف أيضاً بالصبغ التفريقي لاستخدامها في التفريق بين المجاميع المختلفة من البكتيريا وذلك تبعاً لاختلاف تركيبها من الناحية الكيميائية والفيزيائية وهي من أهم طرق الصبغ المستعملة في تقسيم البكتيريا . و أول من استعملها العالم كريستيان جرام و باستعمالها يمكن تقسيم البكتيريا إلى نوعين حسب تفاعل الخلايا البكتيرية مع هذه الصبغة.
موجبة لصبغة جرام عند اكتساب الخلية البكتيرية المعقد المتكون من صبغة الكريستال البنفسجي وصبغة اليود وسالبة لصبغة جرام إذا أزيلت الصبغة باستخدام مذيب عضوي مثل الكحول أو الأسيتون وللتمكن من رؤية الخلايا التي فقدت الصبغة يمكن استخدام صبغة أخرى مثل السفرانين والتي تعرف بالصبغة العكسية Counter stain.
ويعود سبب الإختلاف في هذا التقسيم إلى الإختلاف في تركيب الأسطح الخارجية والجدار في البكتيريا , فالخلايا الموجبة لصبغة جرام تحتوي على طبقات عديدة من الببتيدوجلايكان التي تحتفظ بالمعقد المتكون من اتحاد الكريستال البنفسجي مع اليود أما في البكتيريا السالبة لصبغة جرام فتكون طبقة الببتيدوجلايكان رقيقة بحيث يمكن إزالتها بالكحول وإزالة الصبغة العالقة بها .
وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا السالبة لصبغة جرام تكون دائماً سالبة أما الخلايا الموجبة لصبغة جرام فيمكن أن تفقدهذه الخاصية وتظهر بأنها سالبة خاصة إذا تقدمت في السن أو نتيجة ارتفاع درجة الحموضة لذلك يجب استخدام مزارع بكتيرية لايزيد عمرها عن 24 ساعة .
وتتلخص خطوات الصبغ بما يلي :
• الصبغة الأساسية Primary stain وهي الكريستال البنفسجي تعمل على صبغ جميع الخلايا البكتيرية سواءاً موجبة أو سالبة بلون الصبغة البنفسجي .
• المثبت Mordant مثل محلول اليود الذي يرتبط مع صبغة الكريستال البنفسجي ليكون المركب المعقد CV-I .
• عند غسيل الخلايا بالكحول الإيثيلي يزول المركب المعقد من بعض الخلايا وتحتفظ به الخلايا الأخرى .
• يصبغ محلول الصبغة الثانوية أو العكسية Secondary or counter stain مثل السفرانين الخلايا التي فقدت المركب المعقد الأساسي ولكن لا يؤثر بالخلايا التي احتفظت بالصبغة الأولى . وتسمى الخلايا التي اكتسبت الكريستال البنفسجي بموجبة لصبغة جرام والتي صبغت بالسفرانين سالبة لصبغة جرام .
ملاحظة: قام العالم هوكر بإجراء تعديلات طفيفة على طريقة جرام وأصبحت الأكثر استخداماً
وهي كما يلي :
المواد والأدوات اللازمة:
1- صبغة قاعدية (الصبغة الأساسية) وهي صبغة الكريستال البنفسجي crystal violet أو صبغة الجنشيان البنفسجى .
2- العامل المرسخ وهو صبغة اليود ( وهي مادة تزيد من ترسيب الصبغة وتثبيتها على سطح الخلية ) .
3- عامل مزيل للون وهو الكحول الإيثيلي المطلق 95 % أو الأسيتون ( يعمل على إزالة الصبغة من الخلية المصبوغة ) .
4- الصبغة المضادة وهي صبغة السفرانين ( صبغة ذات لون أحمر تعطي الخلايا التي فقدت الصبغة الأساسية لوناً مخالفاً عن الصبغة الأساسية ) , أو صبغة أزرق الميثيلين (إذا استخدمنا صبغة الجنشيان البنفسجي بدلاً من صبغة الكريستال البنفسجي ).
5- مزارع بكتيرية موجبة وسالبة لصبغة جرام على ألا يزيد عمر المزرعة عن 24 ساعة لأن البكتيريا القديمة غالباً ما تختلف استجابتها للصبغة فتعطي نتيجة مغايرة – شرائح – أحواض للصباغة – ماء مقطر- مجهر- زيت عدسات- إبرة تلقيح .

خطوات العمل :
1- نحضر الغشاء البكتيري كما سبق.
2- نغمر الغشاء البكتيري بصبغة الكريستال البنفسجي لمدة دقيقة ( يمكن استخدام صبغة الجنشيان البنفسجي بدلاً من الكريستال البنفسجي ).
3- نغسل الشريحة جيداً بالماء المقطر الخفيف .
4- نغمر الغشاء البكتيري بمحلول اليود لمدة دقيقة واحدة.
5- نغسل الشريحة بالماء المقطر جيداً.
6- نغمر الشريحة بالكحول الإيثيلي المطلق 95% أو محلول الكحول – أسيتون لمدة 20 ثانية أو نغسل الشريحة بالكحول بلطف حتى يظهر الكحول المنسكب عن الشريحة رائقاً.
7- نغسل الشريحة جيداً بالماء المقطر.
8- نغمر الغشاء البكتيري بصبغة السفرانين ( يمكن استخدام صبغة أزرق الميثيلين بدلاً من السفرانين في حال استخدام صبغة الجنشيان البنفسجي ) لمدة 30 ثانية.
9- نغسل الشريحة بالماء المقطر ثم نجففها باللهب.
10- افحص الشريحة باستخدام العدسة الزيتية فإذا ظهرت الخلايا مصبوغة باللون البنفسجي تكون الخلايا موجبة لصبغة جرام أما إذا ظهرت باللون الأحمر تكون الخلايا سالبة لصبغة جرام .
** يمكن اتباع نفس الخطوات السابقة ( صبغة جرام ) للتعرف على نوع بكتيريا اللبن من حيث
صبغة جرام وكذلك التعرف على شكل الخلايا .
– نلاحظ أن الخلايا البكتيرية الموجبة لصبغة جرام تكتسب لون صبغة الكريستال البنفسجي فتظهر باللون البنفسجي أما الخلايا السالبة لصبغة جرام فتظهر باللون الأحمر لاكتسابها لون صبغة السفرانين .