دراسة بكتيريا الحليب و الالبان , Study of milk bacteria

يعد الحليب ملائماً لنمو الكثير من أنواع الميروبات نظراً لقيمته الغذائية . بعض أنواع البكتيريا لها القدرة على استخدام سكر الحليب ( اللاكتوز) وتنتج حمض اللاكتيك من عملية تخمر السكر Sugar fermentation وقد تنتج بعض الغازات ويمكن استخدام بكتيريا الحليب المنتجة للحمض في صناعة اللبن الزبادي .
ويمكن التعرف على بكتيريا الحليب من خلال عمل غشاء من اللبن أو الحليب على شريحة وصبغه بصبغة جرام فينتج في الغالب نوعين من البكتيريا أحدهما عصوي في سلاسل وهو جنس Lactobacillus سالب لصبغة جرام و الآخر كروي في سلاسل من جنس Streptococcus lactis موجب لصبغة جرام .
فوجود الميكروبات يعد أمراً طبيعياً غير أن وجوده بأعداد كبيرة يكون ضاراً أو وجود ولو عدد قليل من البكتيريا الممرضة يكون غير صالح للإستهلاك .
و في حال تلوث الحليب المبستر بأنواع من البكتيريا وأهمها بكتيريا القولون Coliform bacteria التي تعد من البكتيريا الهوائية أو لاهوائية اختيارية وذات خلايا عصوية سالبة لصبغة جرام , فيدل ذلك على تلوث الحليب أو عدم كفاءة البسترة أو حدوث تلوث بعد عملية البسترة .

ومن الأعمال الواجب القيام بها عند فحص عينة حليب ما يلي :
* التعرف على عدد الميكروبات الموجودة في الحليب فكلما زاد العدد أدى ذلك إلى فساد الحليب وعدم صلاحيته .
* الفحص المخبري باستعمال اختبارات خاصة لمعرفة نوع الميكروب الموجود في الحليب حيث أن وجود أي كائن ممرض ولو بعدد قليل لايمكن استخدامه .

وسنقوم الآن باستعراض التجارب المعملية للقيام بهذه الدراسة

أ – اختبارات تلوث اللبن المبستر :

أولا: تقدير عدد الخلايا البكتيرية Total count of bacteria :

تقدر أعداد الخلايا البكتيرية في عينة اللبن باستعمال طريقة العد الميكروسكوبي المباشر بأخذ عينة من اللبن وفحصها تحت المجهر لعد الخلايا ثم حساب عدد الخلايا البكتيرية في 1 ملل من اللبن بالطريقة الحسابية التالية .
10 مجالات x 50000 = العدد في 1 ملل حليب

خطوات العمل :
1- نقوم بعمل غشاء للبن على شريحة وبعد جفافه تغمر الشريحة في الزيلول أو أي مذيب عضوي للتخلص من الدهون .
2- نغسل الشريحة بالماء للتخلص من آثار الزايلول .
3- نصبغ الغشاء بصبغة السفرانين لمدة دقيقة ثم نغسل الشريحة بالماء .
4- نجفف الشريحة ثم تفحص تحت المجهر باستخدام العدسة الزيتية ونقوم بتقدير عدد الخلايا البكتيرية في 1 مل من العينة .

كما يمكن العد بطريقة الأطباق المصبوبة وهي كما يلي :
طريقة أخذ العينات :
بالنسبة لعينة اللبن تؤخذ مباشرة من العينة سواءاً طازجة أو مبسترة ويعمل التخفيفات منها كما سيرد لاحقاً مع مراعاة وضعها في زجاجات نظيفة ومعقمة .

طريقة العمل :
1- اعمل تخفيفات لعينة من اللبن الطازج ( الخام ) بوضع 1 ملل في أنبوب يحتوي على 9 ملل من الماء المعقم والمقطر بواسطة ماصة معقمة ثم كرر العملية بأخذ1 ملل من عينة من لبن مبستر .
2- خذ من الأنبوب الأول 1 مل وانقله إلى الأنبوب الثاني وهكذا فنحصل على التخفيفات 1/10 , 1/100 , 1/1000 ,1/10000 , 1/100000 .
3- خذ أطباق بتري تحتوي على بيئة الآجار المغذي أو بيئة آجار اللبن غير متصلبة وضع ا ملل من كل أنبوب من الخطوة 1 في الأطباق مع تسجيل كل تخفيف ثم اخلط البيئة مع العينة جيداً بحركة دورا نية .
4- اترك الأطباق حتى تتصلب ثم ضعها في الحضان عند 35 ْم لمدة 48 ساعة .
** يجب تدوين جميع المعلومات على الأنابيب والأطباق .
بعد فترة التحضين تعد المستعمرات و تضرب في مقلوب التخفيف للحصول على عدد الخلايا في 1 ملل من الحليب .
ملاحظة : يمكن تكرار هذه العملية بالنسبة لعينة من الماء كما سيرد لاحقاً .

ثانيا: اختبار أزرق الميثيلين :
يعد هذا الإختبار من الإختبارات المهمة لمعرفة مدى نظافة الحليب في حال عدم توفر الأجهزة اللازمة كما في بعض مختبرات الدراسة ويلاحظ أثناء إجراء هذا الإختبار أن اللون الأزرق للصبغة يزال بسرعة أكبر في حال وجود أعداد كبيرة من الميكروبات في عينة اللبن نتيجة عملية الإختزال للصبغة .

خطوات العمل :
1- ضع 1 مل من أزرق الميثيلين مخفف بنسبة 1/10000 في عدة أنابيب اختبار .
2- أضف إلى كل أنبوب 10 مل من عينات اللبن التي لديك بسرعة .
3- ضع الأنابيب في حمام مائي عند 35 ْم بحيث تفحص الأنابيب بعد نصف ساعة لملاحظة
اختفاء اللون الأزرق بنسبة 80% فالأنبوبة التي يحدث فيها اختزال اللون ( اختفاؤه ) توضع جانباً ويسجل عليها الوقت .
5- تعاد الأنابيب المتبقية إلى الحمام المائي لنصف ساعة أخرى ثم تفحص كما في الخطوة السابقة , وتكرر العملية كل نصف ساعة حتى يلاحظ ما يحدث من تغيير ( تجرى هذه التجربة لمدة 24 ساعة ) .

ثالثا: اختبار اختزال صبغة الرسازورين :
يعتمد هذا الإختبار على نفس المبدأ تقريبا لاختبار اختزال أزرق الميثيلين إلا أن هذا الإختبار يعد أكثر دقة من حيث النتيجة المتحصل عليها وذلك لأن صبغة الرسازورين تعطي لوناً أزرقاً في الوسط المتعادل وعند الإختزال تبدأ بإعطاء ألوان متدرجة تبعاً لقوة الإختزال وكميته فتبدأ من اللون البنفسجي ثم اللون النيلي ثم اللون القرنفلي .

خطوات العمل :
1- ضع في أنبوبة معقمة 1 مل من محلول الرسازورين .
2- يضاف 10 مل من عينة اللبن مباشرة وتسد الأنبوبة بغطاء معقم .
3- ضع الأنبوبة في حمام مائي عند 35 ْم لمدة ساعة ثم افحصها واحسب الوقت الذي استغرقته العينة لتأخذ اللون القرنفلي .
ملاحظة: يمكن استخدام مقياس للون للحصول على نتيجة دقيقة وهذا المقياس يسمى
مقياس مونسل .

رابعا: دراسة بكتيريا حمض اللاكتيك :

طريقة العمل :
1- حضر غشاء بأخذ جزء صغير من لبن زبادي أو حليب قديم واخلطه جيداً بكمية قليلة من الماء المعقم على سطح شريحة ثم افرده على سطح الشريحة بإبرة التلقيح ذات الحلقة .
2- ثبت الغشاء البكتيري بتجفيفه بالحرارة .
3- بعد أن تبرد الشريحة اغسل الغشاء بالكحول بحذر لإزالة الدهون الموجودة في اللبن.
4- اغسل الشريحة بالماء الجاري .
5- أصبغ الغشاء بصبغة جرام ثم افحص الشريحة تحت المجهر .
6- لاحظ وجود نوعين من البكتيريا Lactobacillus lactis ذات خلايا عصوية في سلاسل سالبة لصبغة جرام وأخرى Streptococcus lactis ذات خلايا كروية في سلاسل موجبة لصبغة جرام .