فحص وزراعة الدم للكشف عن الميكروبات , Blood culture

يعتبر الدم في وضعه الطبيعي معقماً إلا أن بعض الكائنات الدقيقة قد تظهر فيه لسبب أو آخر بسبب تلوث الدم Bacteremia وقد تصل هذه الخلايا للدم من أحد أجهزة الدم وغالباً يتم القضاء عليها بفعل الملتهمات Macrophages والكبد والطحال إذا كان عددها قليلاً أما في حال وجودها بعدد كبير فقد لاتتمكن مناعة الجسم من القضاء عليها .
ويحدث تجرثم الدم بثلاثة أشكال وهي :
1- تجرثم الدم العابر ( قصير الأمد ) Transient Bacteremia :
وذلك عند مرور البكتيريا في الدم لمدة قصيرة والتي يكون مصدرها من خارج الأوعية الدموية مثل أوعية الأنف أو نتيجة القرحة المعدية وتكون هذه المرحلة بدون أعراض .
2- تجرثم الدم المتردد Inntermittent Bacteremia :
يكون مصدر الجراثيم البكتيرية من خارج الأوعية الدموية مثل العقد اللمفية بحيث تنفذ إلى مجرى الدم لوجودها بعدد كبير وتكون هذه المرحلة ذات أعراض مثل القشعريرة وارتفاع درجة الحرارة وقد يؤدي للأصفرار في بعض الحالات .
تجرثم الدم الحاد Chronic Bacterimia :
وتكون أعداد البكتيريا بشكل كبير بسبب الألتهابات الحادة في الدم أو تكاثر البكتيريا في الدم أو وصولها للدم بعدد كبير مثل التهاب المرارة أو الطحال والكبد .

الكائنات المسببة لالتهاب الدم :
α-β Haemolytic streptococcus , Enterococci , Clostredium perfrenges , Proreus spp. , Nesseria meningitidis , Brucella spp. , Leptospira spp. , Staphylococcus coagulase +ve and –ve , Pneumococci , Haemophylous influenza and capsulatum , Pseudomonas spp. , Bacteroides spp. , Salmonella spp. , Viberio fetus and related vibrios , Nocardia , Bacterium dermatitidis , Candida .

خطوات فحص الدم :
تعتبر زراعة عينة الدم من أهم العينات التي تحدد نوع المرض مثل التهاب الرئة Pneumococcal pneumonia والتهاب السحايا البكتيري Bacterial meningitis والتهاب المسالك البولية وحمى التيفوئيد Typhoid fever و الأصابات بالسالمونيلا والتهاب الجروح Wound infictions والتهاب المرارة Infection off gall bladder والتهاب القناة الصفراوية والتهاب العظام والتهاب الغشاء المبطن للبطن .
ويتم جمع عينات الدم بسحبه مباشرة بواسطة إبرة معقمة مع مراعاة تعقيم الجلد باليود وكذلك بالكحول لمنع تلوث العينة بالميكروبات الموجودة على الجلد بحيث يسحب 10 – 12 ملل من الدم وتنقل العينة إلى أنبوب معقم به 3.4 ملل من مانع التجلط Lioquoid بتركيز 0.35 % مذاب في محلول saline ( هذا المانع مفيد في معادلة نشاط المضادات التالية خاصة إذا أخذ المريض أحداها قبل أخذ العينة مثل streptomycin , kanamycin , gentamycin , polymyxin ) أو يمكن استخدام مانع التجلط Na-citrate .
يؤخذ 5 ملل من الدم وتضاف إلى 100 ملل من بيئة Thioglycolate medium وذلك لتنمية البكتيريا اللاهوائية بحيث تحضن في ظروف لاهوائية . والباقي تضاف إلى قنينة بها 100 ملل من بيئة Trypticase soybroth .
و ينصح باستخدام قنينة محتوية على 100 ملل من المرق المغذي المكون من البيئات التالية :
Thioglycolate , Trypticase soybroth , Brain heart infusion , Pepton water , Broth Brucella . كما يتم إضافة 10 % سكروز و Penicillinase ( في حال أخذ المريض علاج البنسيلين ) و مانع للتجلط .
وتحضن القناني عند 35 – 37 ْم في ظروف هوائية بحيث تفحص يومياً خلال الأسبوع الأول وعدة مرات يومياً في الأسبوع الثاني للتأكد من وجود أو عدم وجود النمو البكتيري .

ويكون النمو البكتيري بعدة أشكال وذلك بحسب الميكروب الموجود في الدم :
عند نمو العصويات السالبة لجرام تكون الطبقة فوق الخلايا الحمراء معكرة بشكل متناسق مع وجود فقاعات هوائية بسبب تخمر سكر الجلوكوز .
عند وجود Pneumococci أو Meningococci يشبه النمو السابق ولكن تكون نسبة العكورة أقل مع ظهور لون أخضر في البيئة .
تنمو Streptococci فقط في بيئة Thioglycolate وتظهر على شكل كرة قطنية على سطح راسب الخلايا الحمراء في قاع القنينة بينما تكون الطبقة العلوية من الميديا صافية دون شوائب .
وعند نمو beta haemolytic streptococci أو أي من محللات الدم فإن تحلل الدم يظهر بوضوح مع وجود العكورة .
عند نمو الممرضات من Staphylococci تُظهر طبقة متجلطة مثل الجيلي على سطح البيئة بفعل إنتاجها إنزيم Coagulase .
عند تلوث البيئة السائلة ببكتيريا Bacillus أو Saprophytic fungi فإنه يحصل تحلل للدم في الوسط السائل وسيتكون تجمعات سميكة على السطح .
تنمو بكتيريا Clostridium في بيئة الثيوجلايكوليت منتجة تحلل للدم مع ظهور رائحة عفنة وغاز تحت الضغط .
عند نمو H.influenza لايحدث أي تغير في البيئة ولابد من زراعتها مرة أخرى على وسط Chocolate agar .
عند الإستمرار في التحضين لمدة تزيد عن 10 أيام تزداد العكورة في بيئة الثيوجلايكوليت بسبب وجود الفيبرين الذي يتكون فوق طبقة خلايا الدم مما يسبب الإعتقاد بوجود نمو بكتيري .
وللتأكد من أن العكورة تحتوي على نمو بكتيري فلابد من عمل شريحة وصبغها بصبغة جرام .
عند التأكد من وجود نمو في البيئة تنقل عينة من المزرعة إلى طبق به بيئة Blood agar و أنبوب به Thioglycolate broth . وعند احتمالية وجود H.influenza تزرع على بيئة Chocolate agar . أما وجود العصويات السالبة لجرام فتنقل العينة إلى بيئة EMB أو Macconkey agar .
عند ظهور نتيجة إيجابية يفضل إجراء فحص التحسس للمضادات الحيوية .

وهناك طرق مفضلة لزراعة عينة الدم يفضل استخدامها في المعمل :
طريقة المزارع السائلة Broth culture procedure :
بعد 18 – 24 ساعة من التحضين للقنينة المحتوية على بيئة Thioglycolate تخلط القنينة جيداً وينقل واحد لوب منها ومن Blood broth إلى طبق من Bloood agar وطبق من Chocolate agar وفي نفس الوقت يحضر شريحة من Blood broth ( غشاء رقيق ) ويصبغ بصبغة جرام ويعاد تحضين القنينتين لإكمال فترة التحضين إلى 14 يوم .
تحضن أطباق Blood agar و Chocolate agar في Candle jar وتفحص الأطباق بعد 24 – 48 ساعة مع التخلص من الأطباق في حال كون النتيجة سالبة.
بعد 14 يوم من التحضين للقنينتين المحتويتين على بيئة Thioglycolate و بيئة Blood broth أعد الخطوة السابقة ( رقم 1 ) ثم تخلص من القنينتين السابقتين إذا كانت الشريحة تشير إلى نتيجة سالبة وكذلك الأطباق إذا كانت نتيجتها سالبة بعد تحضينها لمدة 48 ساعة .

طريقة مزارع الثيوجلايكوليت السائلة Thioglycolate culture broth :
بعد تحضين بيئة الثيوجلايكوليت لمدة 18 – 24 ساعة اعمل شريحة واصبغها بصبغة جرام وأعد الزراعة على طبق Blood agar وأنبوب Thioglycolate broth ثم حضنهما لمدة 24 – 48 ساعة إذا أعطت نتيجة سالبة تخلص من الطبق والأنبوب . مع الأخذ بعين الإعتبار استمرار التحضين للقنينة المحتوية على Thioglycolate لمدة 14 يوم .
بعد 14 يوم من التحضين أعد الخطوة السابقة ( رقم 1 ) وتخلص من القنينة والطبق والأنبوب إذا كانت النتيجة سالبة لكل منهم وكذلك إذا كانت نتيجة الشريحة سالبة وذلك بعد تحضين الأطباق الجديدة لمدة 48 ساعة .
عند ظهور بكتيريا في الشريحة ولم يظهر نمو على الأطباق المحضنة هوائياً فيجب عمل طبق من Blood agar وتحضينه في ظروف لاهوائية .

الأنظمة الآلية لمزارع الدم Automated blood culture systems :

يوجد في الوقت الحاضر العديد من الأنظمة الحديثة والآلية لفحص عينة مزرعة الدم وتحديد وجود النمو في مزارع الدم بحيث يتم باستخدامها توفير الوقت في سرعة تحديد ومعرفة حدوث النمو للبكتيريا وكذلك الدقة في التحديد .
وتقوم هذه الطرق بقياس النمو وتحديده بقياس نسبة ثاني أكسيد الكربون الناتج من تحلل السكر في المزرعة . ومن هذه الأنظمة الأكثر شيوعاً :
نظام Bactec :
تعتمد هذه الطريقة على قياس نسبة ثاني أكسيد الكربون في مزرعة الدم وذلك بطريقتين :
تعتمد على قياس نسبة ثاني أكسيد الكربون بالطريقة الإشعاعية بحيث يستخدم مركب السكر المحتوي على الكربون المشعglucose 14 C بحيث تستهلكه البكتيريا وتنتج ثاني أكسيد الكربون المحتوي على الكربون المشع . وبالتالي يتم قياس نسبة ثاني الكربون المنتج في المزرعة والمحتوي على الكربون المشع لتحديد وجود النمو البكتيري من عدمه ( أي عند عدم وجود ثاني أكسيد الكربون المشع في المزرعة يدل على عدم وجود البكتيريا ) .
تقاس كمية ثاني أكسيد الكربون في بداية الزراعة ثم تتابع القياسات لمعرفة الزيادة في كمية ثاني أكسيد الكربون كمؤشر لوجود البكتيريا ونموها وذلك باستخدام جهاز المطياف المزود بالأشعة تحت الحمراء Infrared spectrophotometer .

نظام Bac-T/Alert :
يعتمد هذا النظام على قياس تغير لون المزرعة بسبب زيادة نسبة ثاني أكسيد الكربون في المزرعة والذي يؤدي بدوره إلى تغير PH الوسط من قاعدي إلى حامضي والذي يدل عليه تغير لون الدليل المضاف للمزرعة وباستخدام جهاز الطيف الضوئي العادي يمكن قياس التغير في لون الوسط المزروع .

http://www.biomerieux-industry.com/upload/BTA_240_ret214.jpg

صورة جهاز Bact/alert والكواشف المستعملة

الطرق غير المزرعية :
وذلك من خلال الكشف عن الأنتيجينات البكتيرية أوالأجسام المضادة الخاصة بمسبب المرض وذلك بالطرق المصلية مثل استخدام فحص Latex agglutination وطريقة ELISA .
كما يمكن استخدام تقنية PCR للكشف عن العديد من جراثيم الدم .
ويمكن استخدام طريقة الكروماتوجرافي للكشف عن وجود نواتج الأيض الناتجة من الميكروب مثل الأحماض الدهنية والسموم .