عزل وتعريف المزارع البكتيرية , The isolation and identification of bacterial culture

من الضروري في الدراسات الميكروبية دراسة وفهم العمليات الحيوية التي تقوم بها الميكروبات وكذلك دراسة وفهم العوامل البيئية التي تؤثر عليها وتتأثر بها أو ما يعرف بالبيئة الميكروبية microbial ecology التي تهدف لفهم علاقة الميكروبات بكل مظاهر الوسط الذي تعيش فيه سواء فيزيائية أو كيميائية أو غذائية أو البيولوجية . والتحكم في الميكروبات في النواحي الطبية والصناعية والغذائية في التطبيق العملي يعتمد على فهم العلاقة بين الميكروبات والعوامل البيئية بشكل جيد .
ومن النادر احتواء أي وسط بيئي على نوع واحد من الميكروبات ولكنها دائماً تكون متداخلة فلكي يتم دراسة كل نوع على حدة لابد أن يتم عزل كل نوع بشكل منفصل عن غيره كما ورد سابقاً في بعض التطبيقات التي قمنا بدراستها , وذلك اعتماداً على الخواص الكيميائية والإحتياجات الغذائية والبيئية والتي تختلف من نوع لآخر والتي يمكن استخدام هذه الخواص التي تختلف بحسب الكائن الدقيق في توفير هذه الظروف المعيشية لعزله بشكل منفرد للإستفادة منه في الدراسة أو في أي مجال من مجالات الحياة .
وليتم عزل الميكروبات بشكل منفرد عملياً يمكن توفير بعض العناصر الكيميائية أو الحيوية أو الظروف المناسبة للأغراض التالية :
1- تثبيط نمو الميكروبات غير المرغوبة وتشجيع نمو الكائن المرغوب .
2- تشجيع نمو الميكروب المرغوب بحيث يتكاثر ويتغلب على الميكروبات الأخرى .

استخدام المزارع الإنتقائية والإغنائية في العزل use of selective and enrichment culture :

قام العلماء بمحاولة محاكاة البيئة المحيطة بالميكروبات ومحاولة توفير الظروف المناسبة لكل كائن إلا أن هذه العملية معقدة ومكلفة لذا قام الكثير من العلماء بتطوير الطرق التي يستفاد منه في العزل النقي فتمكنوا من وضع أساس مهم لهذه العملية وهو استخدام مزارع الإنتقاء والإغناء ( الإكثار ) للحصول على المزارع النقية مثل استخدام لكتات الصوديوم التي تحفز نمو أجناس معينة مثل veillonella , propionibacterium أو استبعاد مركبات النيتروجين لتشجيع نمو الأجناس المثبتة للنيتروجين وكذلك حجب الأكسجين يشجع نمو الأجناس اللاهوائية .
ومما هو جدير بالذكر أن عدداً من الميكروبات يتشابه في الظروف البيئية التي تنمو بها فلابد من عمل مزارع أخرى كمرحلة لاحقة كالأطباق المصبوبة أو المنتشرة ليتم عزل كل كائن بمعزل عن الآخر .
ومن الأمور التي تساعد على عزل دقيق وسريع لنوع معين من الميكروبات فيمكن استخدام كواشف معينة لتحديد النوع المرغوب بسهولة كوضع كاشف للحموضة لعزل الميكروبات المنتجة لليوريا أو المحللة للسليولوز وغير ذلك .
ومن المصادر التي يمكن الحصول منها على أنواع معينة من الميكروبات , التربة والماء والوحل والهواء ومياه الآبار والبرك بالنسبة للأنواع التي لايعرف لها مصدراً بعينه , بينما هناك أنواع يلزم البحث عنها في مصادر محددة مثل الألبان خاصة الخام الحامض sour raw milk للحصول على streptococcus lactis أو الفواكه عند عزل Acetopacter أو البراز لعزل Streptococcus faecalis .

استخدام طريقة الأطباق التفريقية Differential plating

سيتم عرض مثالين لهذه الطريقة فالمثال الأول سوف نبحث عن البكتيريا المخمرة للبن وذلك بوضع دليل للحموضة في بيئة آجار اللاكتوز , أما في المثال الثاني سيتم البحث عن بكتيريا محللة للكازيين ( كما مر سابقاً ) .

خطوات العمل :

1- بكتيريا تخمر اللاكتوز .
– أسل ثلاثة أنابيب من بيئة اللاكتوز ومستخلص الخميرة المحتوية على دليل بروم كريزول بربل ثم بردها عند 45 ْم .
– اعمل أطباقاً مصبوبة من عينة اللبن التي أمامك باستخدام طريقة التخفيف بالغمس ( بوضع 3 غمسات بإبرة التلقيح ) .
– حضن الأطباق عند 37 ْم لمدة 48 ساعة
افحص الأطباق للمستعمرات المحاطة بهالة صفراء حيث إن الدليل يعطي لوناً أصفراً عند رقم هيدروجيني أقل من 5,2 وهذا دليل على أن الحمض قد تكون في الوسط نتيجة تخمر اللاكتوز .

1- بكتيريا تحلل الكازيين .
– أسل ثلاثة أنابيب من بيئة آجار اللبن الخض skim milk agar ثم بردها عند 45 ْم .
– اعمل أطباقاً مصبوبة بطريقة التخفيف بالغمس ( العينة 1جم من التربة في 9 ملل ماء مقطر ومعقم ) .
– حضن الأطباق لمدة 48 ساعة .
افحص الأطباق للبحث عن مستعمرات حولها هالة رائقة دلالة على تحول الكازيين في الأطباق إلى مادة ذائبة بالتحلل دلالة على حدوث الهضم .
عند عمل شرائح للعينات التي حصلنا عليها سابقاً وصبغها بصبغة جرام سنحصل على صفات مختلفة لكليهما دلالة على اختلاف النوعين الذين تم الحصول عليهما .

2- عزل البكتيريا المكونة للجراثيم .

نحتاج لإجراء هذه التجربة توفير مايلي :
مزارع آجار مغذي بعمر 24 ساعة من Bacillus subtilus , B.cereus , B.megaterium – أنابيب آجار مائل من آجار مغذي , آجار مغذي مضاف إليه 10 ملجرام/لتر من كبريتات المنجنيز – آجار مائل مضاف إليه 0.5 % جلوكوز و 1% فوسفات ثنائي البوتاسيوم .

خطوات العمل :
1- قسم الأنابيب إلى ثلاث مجموعات في كل مجموعة أنبوب من بيئة مختلفة .
2- لقح كل مجموعة بنوع من الأنواع البكتيرية السابقة .
3- حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة ثم افحص النتائج لمعرفة ما إذا تكونت الجراثيم أم لا .
نلاحظ من التجربة السابقة أن هذه الطريقة تعيننا على عزل البكتيريا المتجرثمة ثم مقارنة الأنواع المختلفة من حيث قدرتها على التجرثم وكذلك دراسة تأثير المواد المختلفة على تكوين الجراثيم . ويمكن فحص النتائج بعمل شرائح لفحص الجراثيم كما مر سابقاً في دراسة طريقة صبغ الجراثيم .

طريقة الأطباق الإنتقائية selective plating :

يمكن انتقاء ميكروب معين من خليط من الميكروبات بإعداد بيئة الإنتقاء بوضع مثبط معين لتثبيط النوع غير المرغوب والسماح بنمو النوع المرغوب مثل استخدام المضادات الحيوية أو استخدام مواد كيميائية معينة , وسنقوم بعض مثالين على ذلك مع الإستفادة من بعض التجارب المذكورة سابقاً في الكتاب .

أ – العزل من عينة عصير متخمرة :
استخدام بيئة آجار الأكتيديون actidione agar :

1- قم بإسالة أنبوبتين من آجار الجلوكوز المحتوية على 15 ملل .
2- برد الأنبوبتين إلى 45 ْم وصب إحداها في طبق لآستخدامه في التخطيط .
3- أضف إلى الأنبوبة الأخرى – تحت ظروف التعقيم – 1 ملجرام من الأكتيديون ثم رج الأنبوبة بشكل جيد ثم صب الأنبوبة في طبق آخر .
4- خطط الطبقين بالعصير المتخمر .
5- حضن الأنبوبتين عند 30 ْم لمدة 48 ساعة .
لاحظ نمو الفطر على الطبق الذي لايحتوي على الأكتيديون وتمنع عزل مستعمرات البكتيريا بينما منع نمو الفطر بوجود الأكتيديون في الطبق الآخر لأنه يعتبر مضاد حيوي لكثير من أنواع الفطريات بينما يسمح بنمو البكتيريا التي لا تتأثر به .

ب- استخدام آجار الأزيد وبيئة آجار الأيوسين وأزرق الميثيلين azid and EMB Agar :

1- قم بإسالة 3 أنابيب من بيئة آجار التربتون ومستخلص الخميرة المحتوية على 0.02 % أزيد الصوديوم و3 أنابيب من آجار EMB ثم بردها عند 45 ْم .
2- استخدم طريقة التخفيف بالإبرة بالعزل من عينة براز على كلتا البيئتين بطريقة الأطباق المصبوبة .
3- حضن الأطباق عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
4- باستخدام إبرة التلقيح انقل مستعمرتين من المستعمرات بحجم رأس الدبوس النامية على بيئة الأزيد ومستعمرتين من أطباق EMB إلى أربعة أنابيب من بيئة مرق التربتون ومستخلص