عزل الطحالب من الماء والتربة , Isolation of Algae from water and soil

تعيش الطحالب في كل من التربة الرطبة والمياه بغزارة ومنها ما هو وحيد الخلية ومنها متعدد الخلايا , ويمكن أن نستدل عليها بعزلها من بيئات مختلفة مثل المياه العذبة والمالحة والهواء و التربة وذلك بمزجها مع محلول معدني خاص لتنميتها ومنع نمو البكتيريا والأعفان المترممة وذلك لعدم احتوائها على الكربوهيدرات كمصدر للكربون. والطحالب كما هو معروف قادرة على إنتاج غذائها بعملية البناء الضوئي حيث أنها تحتوي على البلاستيدات المحتوية على الكلوروفيل .
وسنستعرض في هذا الجزء الطرق المنتخبة لعزل وتنقية الطحالب المجهرية isolation and purification of microscopic algae .

المواد والأدوات اللازمة:
100 ملل من محلول بيئة الطحالب السائلة في قارورة 250 ملل.
عينات تربة من أماكن مختلفة و عينة ماء سطحية – ماصات معقمة – ماصات شعرية – إبر تلقيح – أنابيب اختبار – أنابيب طرد مركزي.
وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن اتباع أكثر من طريقة لعزل الطحالب ومنها :

أ- العزل المباشر في بيئة الطحالب :
طريقة تحضير بيئة الطحالب :
1- نترات الكالسيوم Ca(NO3)2 2 جم
2- كلوريد البوتاسيوم KCl 0.5 جم
3- كبريتات المغنيسيوم المائي MgSO4 0.5 جم
4- فوسفات أحادي البوتاسيوم KH2PO4 0.5 جم
5- ماء الصنبور 1000 ملل
** نخفف جزءاً واحداً من هذا المحلول مع خمسة أجزاء من ماء الصنبور.
6- كلوريد الحديد المائي FeCl3.6H2O 0.01 جم
** يمكن استخدام البيئات التالية أيضاً لإتمام العمليات الخاصة بدراسة الطحالب كم سيرد لاحقاً .

بيئة المرق المغذي : تحضر كما ذكر سابقاً .
بيئة جلوكوز تربتون sst :
جلوكوز 1 جم
تربتون 1 جم
مستخلص خميرة 0.5 جم
ماء مقطر 100 مل

بيئة بيبتون جلوكوز :
جلوكوز 1 جم
بيبتون 1 جم
ماء مقطر 1 لتر
ويجب عند تحضير هذه البيئات القيام بتعقيمها قبل الإستخدام .

خطوات العمل:

1- خذ 1 جم من التربة أو من أحد البيئات المنتخبة وضعها في القارورة المحتوية على بيئة الطحالب .
2- ضع القارورة في مكان دافئ معرض للضوء لمدة أسبوع الى عشرة أيام .
3- خذ 1 ملل من ماء البركة وضعه في قارورة ثانية وحضن كما سبق .
4- بعد فترة التحضين خذ عينات على شرائح وغطها بغطاء شريحة ثم افحصها تحت الجهر .
5- سجل النتائج وقارنها مع زملائك في المجموعات الأخرى .

ب- طريقة ماصة باستير المعقمة sterile pasteur type pipette :
1-تسخن الأطباق وزجاجات الساعة الخاصة بالعزل لتعقيمها وكذلك تسخن ماصات باستير .
2-يوضع من 6-8 قطرات من بيئة الطحالب في زجاجة الساعة الموضوعة في طبق بتري معقم ويحتفظ بالأطباق مغطاة دائماً .
3-يوضع 2 – 3 قطرات من الطحالب المجموعة من البيئة الطبيعية في البيئة السائلة للطحالب الموجودة في زجاجة الساعة كما ويمكن تخفيف العينة حسب كثافة الطحالب أو بحسب تنوع الطحالب الموجودة في البيئة الطبيعية .
4-تحضر الماصة الشعرية بوضع الساحب المطاطي في نهايتها العريضة وتعقم نهاية الماصة الدقيقة بتعريضها للهب الخفيف .
5-تسحب العينات الطحلبية بالماصة تحت المجهر المجسم stereomicroscope وذلك بتقريب الجزء الشعري فتسحب العينة الطحلبية بالخاصية الشعرية أو يمكن الضغط على الجزء المطاطي عند الضرورة .
6-تنقل الماصة الشعرية إلى طبق آخر وتوضع العينة فيه وتكرر هذه العملية عدة مرات لغسلها .
7-تنقل العينة الطحلبية بالماصة إلى أنابيب بيئة الزرع culture medium
8-تحضن أنابيب الزرع في الحضان لتوفير درجة الحرارة المناسبة كما يتطلب توفير الإضاءة المناسبة .

ج – طريقة الطبق المخطط streak plating :

تستخدم هذه الطريقة لعزل العينات الطحلبية التي يقل قطرها عن 10 ميكرومتر والتي قد لا تنجح عملية العزل باستخدام طريقة الماصة الشعرية وذلك باستخدام عملية الطبق المخطط للبيئة الصلبة في أطباق بتري .
طريقة العمل :
1- يوضع عدة أطباق بتري تحتوي على بيئة الآجار بنسبة 1 – 1,5 بيئة آجار .
2- توضع قطرة أو قطرتين من عينة الطحالب على سطح الآجار باستخدام الإبرة ذات العقدة المعقمة وذلك بعملية التخطيط كما سبق.
3- تغطى وتقلب الأطباق وتوضع في الظروف المناسبة للنمو لمدة 5 -8 أيام .
4- تفحص العينات تحت المجهر المجسم وتفصل العينات المطلوبة عن الكائنات الدقيقة الأخرى باستخدام الماصة الشعرية أو الإبرة ذات العقدة , وتنقل إلى نقطة منالبيئة السائلة موضوعة على شريحة لفحصها باستخدام المجهر الضوئي عند القوة الكبرى .
5- ويمكن إعادة عملية التخطيط مرة أخرى للعينة المعزولة من الطحالب للتقليل من التلوث الذي قد يحصل من الكائنات الأخرى أو الأنواع الأخرى من الطحالب .

ملاحظة : يمكن عزل الطحالب من الهواء بفتح طبق بتري به آجار مغذي وتعريضه للهواء من خلال نافذة السيارة المتحركة بسرعة 80 – 100 كم ثم تحضينه لمدة 4 – 6 أسابيع عند الظروف المناسبة ثم تجرى طريقة التخطيط على الأطباق لعزلها بصورة نقية .
وهناك عدة طرق متبعة لتنقية العينات الطحلبية ومنها :
أ-طريقة الطرد المركزي centrifugation :
تجرى عملية التنقية بالغسيل وبنقل العينات الطحلبية للبيئة السائلة وإجراء عملية الطرد المركزي كما يلي :
1- تنقل العينات الطحلبية إلى أنابيب الطرد المركزي المليئة إلى نصفها بالبيئة السائلة أو الماء المقطر .
2- تجرى عملية الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق حتى تتفكك العينات الطحلبية .
3- ينقل معلق العينات الطحلبية إلى أنبوب آخر وتجرى عملية الطرد المركزي لخمس مرات .
4- تنقل العينات الفردية التي تم الحصول عليها من عملية الطرد المركزي إلى أنابيب اختبار باستخدام ماصة باستير والتي تحتوي على بيئة الزرع وتترك في الظروف المناسبة للنمو حتى تنمو .
5- يلاحظ النمو الناتج ويجرى خلال ذلك اختبار وجود التلوث البكتيري .
6- تجرى عملية الطبق المخطط بعد التأكد من عدم وجود التلوث البكتيري ثم تكرر عمليتي الغسل والطرد المركزي .

ب – المعاملة فوق الصوتية ultrasonic treatment :

يستخدم لهذه الطريقة حمام مائي فوق صوتي ultrasonic water bath بقوة منخفضة 90 كيلوسيكل في الثانية فيتم تخليص العينة الطحلبية من التلوث الطبيعي كما أنها تتخلص من الملوثات بتكرار الغسل والطرد المركزي للحصول على مزرعة طحلبية نقية .
طريقة العمل :
1- تنقل العينات الطحلبية إلى أنابيب طرد مركزي مليئة إلى نصفها بالماء المقطر أو البيئة السائلة .
2- توضع الأنابيب إلى الحمام المائي فوق الصوتي لمدة 10 – 20 دقيقة بحسب العينة الطحلبية .
3- تجرى عملية الطرد المركزي حتى تتفكك العينات الطحلبية ثم تنقل إلى أنابيب أخرى ثم يضاف لها سائل جديد .
4- تكرر عمليتي الذبذبات والطرد المركزي لخمس مرات .
5- تجرى عملية الطبق المخطط علىأطباق الآجار .
6- يجرى اختبار التلوث كما سبق .
7- تحمل العينات التي تم تنقيتها على شريحة زجاجية ثم تفحص باستخدام المجهر الضوئي .