دراسة العوامل البيئية المؤثرة على نمو الكائنات الحية الدقيقة , الجزء الثاني

دراسة العوامل البيئية المؤثرة على نمو الكائنات الحية الدقيقة -الجزء الثاني
Studying of effective environmental factors on microbial growth -Part 2

6- تأثير اختلاف تركيز الأس الهيدروجيني للبيئة على النمو
Effect of pH medium on growth :
معظم الكائنات الدقيقة تنمو في أوساط ذات درجة تركيز مثلى لأيون الهيدروجين ولكن بعضها ينمو في درجة تركيز هيدروجيني عال ( أي قاعدي ) وبعضها في أوساط منخفضة ( أي حمضية ) .
ومما هو جدير بالذكر أن الميكروبات نتيجة قيامها بالأيض الغذائي تعمل على تغيير الرقم الهيدروجيني للوسط , مثل البكتيريا المنتجة للحمض والفطريات التي تزيد من تركيز أيون الهيدروجين في الوسط إي تحول الوسط إلى وسط حمضي وبعض الميكروبات التعفنية تعمل على خفض تركيز أيون الهيدروجين وبالتالي زيادة الرقم الهيدروجيني فتحول الوسط إلى وسط قاعدي . ويعد تركيز أيون الهيدروجين من أهم المؤثرات على النمو البكتيري بعد تأثير درجة الحرارة . و يلاحظ أن تركيز أيون الهيدروجين قد يتأثر ببعض العوامل التي تؤدي إلى تغيره مثل درجة الحرارة وتركيب البيئة والضغط الأسموزي .

الطريقة الأولى :
خطوات العمل :
1- حضر أربعة أطباق من آجار الجلوكوز لها درجات حموضة مختلفة Ph 3 , 5 , 7 , 9 قسم كل طبق إلى أربعة أقسام ولقح كل قسم في الأطباق بمساحة واحد سنتيمتر مربع بالأ نواع التالية E.coli , Staphylococcus , Saccharomyces , Penicillium
2- حضن الأطباق عند 30 ْم لمدة أربعة أيام ثم لاحظ تركيز الأس الهيدروجيني الأمثل للنمو لكل نوع من الأنواع السابقة .

الطريقة الثانية :
خطوات العمل :
1- حضر المحاليل التالية 0.2 جزيئي فوسفات ثنائي البوتاسيوم و 0.1 جزيئي حمض الستريك و 0.2 جزيئي حمض البوريك و 0.2 جزيئي هيدروكسيد صوديوم .
2- جهز مجموعة من المحاليل المختلفة في قيمة الـ Ph بخلط كميات من المحاليل السابقة كما في الجدول التالي .
3- عقم الأنابيب المحتوية على التراكيز السابقة بالتعقيم المتقطع .
4- لقح كل أنبوبة ببكتيريا E.coli .
5- حضن عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
6- لاحظ النمو بتقدير درجة التعكير ( لايوجد , عكارة خفيفة , عكارة متوسطة , عكارة شديدة) التي تحدث دون رج الأنابيب .

فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.2 جزيئي ( مل )حمض الستريك 0.1 جزيئي (مل)بيئة مرق مغذي (مل)الحجم الكلي (مل)قيمة الـPh بالتقريب0.3- 0.6- 0.9- 1.1- 1.3- 1.5- 1.91.7- 1.4- 1.1- 0.9- 0.7- 0.5- 0.18- 8- 8- 8- 8- 8- 810- 10- 10 -10- 10 -10- 102.8- 3.6- 4.4 -5.2- 6.0- 6.8- 7.6حمض بوريك 0.2 جزيئي (مل)هيدروكسيدصوديوم 0.2 جزيئي (مل)بيئة مرق مغذي (مل)الحجم الكلي (مل)قيمة الـPh بالتقريب1.7- 1.3- 1.00.3- 0.7- 1.08- 8- 810- 10- 108.4- 9.2 -10.0

الطريقة الثالثة :
خطوات العمل :
1- جهز تسعة أنابيب مرق مغذي ( ثلاثة منها Ph5 و ثلاثة Ph7 و ثلاثة Ph9 ) .
2- لقح كل ثلاثة من الأنابيب لها تراكيز مختلفة ببكتيريا E.coli , Staphylococcus aureus , Sporosarcina ureae .
3- ضع الأنابيب بالحضان على درجة 37 ْم لمدة 72 ساعة .
4- قدر بالعين المجردة درجة العكارة في الأنابيب المختلفة .

7- دراسة تأثير الملح على كمية النمو :
نقوم في هذا التدريب على دراسة تأثير الحموضة والملوحة في الوسط الغذائي على نمو الكائنات الدقيقة وذلك من خلال حساب الوزن الجاف للخلايا البكتيرية والفطرية عند استخدام هذه الأوساط ولإثبات مدى تأثر الكائنات الدقيقة بالحموضة والملوحة المنخفضة والعالية .

خطوات العمل :
1 – حضر بيئة المرق المغذي بدون ملح ثم وزعها في دوارق حجم 100 مل بكل منها
50 مل من البيئة .
1- ضع في كل دورق كمية من ملح كلوريد الصوديوم كما يلي:
صفر, 2 , 5 , 10 , 15 , 20 جم . ثم أغلقها بسدادة قطنية وعقمها .
2- تحت اللهب ضع لاقحة من البكتيريا ثم حضن الدوارق عند 37 ْم لمدة 7 أيام .
3- لحساب الوزن الجاف قم بعمل طرد مركزي لكل دورق عند سرعة 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق وذلك لترسيب الخلايا في الأنبوب ثم تخلص من البيئة الرائقة فوق الخلايا .
4- قم بوضع 10 مل ماء مقطر ومعقم ثم رج بشدة لغسل الخلايا من آثار البيئة ثم قم بعملية الطرد المركزي مرة أخرى , كرر عملية الغسيل ثلاث مرات.
5- بعد الغسيل ضع 10 مل ماء مقطر ومعقم و رج الأنبوب جيداً ثم رشح المعلق بورق ترشيح بعد أخذ الوزن الجاف للورقة .
6- قم بأخذ الورقة بما عليها من الخلايا وضعها في فرن جاف عند 70 ْم لمدة 24 ساعة للحصول على خلايا جافة .
7- زن ورقة الترشيح بما عليها من نمو بعد التجفيف ثم اطرح منها وزن الورقة فنكون بذلك قد حصلنا على وزن الخلايا الجاف فقط .

ملاحظة: يمكن استخدام نفس الخطوات ولكن باستبدال الملح بتغيير درجة الأس الهيدروجيني وذلك من خلال استخدام جهاز PH meter وتغيير تركيز الـ ph في كل دورق كما ذكر سابقا.

9- تأثير مصدر الطاقة والمواد المنظمة للحموضة على النمو Effect of energy source and buffer on groth :
يعتمد نمو الميكروبات في البيئة الغذائية غالباً على كمية مصدر الطاقة المتاحة وعندما يستغل الميكروب المصدر المتاح يؤدي إلى إنتاج مواد هي نواتج التفاعل من استخدام المادة الغذائية مما قد يؤدي إلى تغيير درجة حموضة الوسط مما يؤدي تبعاً لذلك التأثير على نمو الميكروب ولتفادي هذه المشكلة يفضل استخدام منظمات الحموضة للحفاظ على النمو بشكل جيد وتقليل تأثير تفاعلات المواد الغذائية ونواتجها .
وسنقوم هنا بدراسة تأثير سكر الجلوكوز على نمو بعض أجناس Streptococcus التي تستخدم هذا السكر كمصدر أساسي للطاقة والذي ينتج من استخدامه حمض اللاكتيك لذا سنستخدم منظم الفوسفات لتنظيم حموضة الوسط .

طريقة العمل :
1- لقح البيئات التالية بمزرعة Streptococcus faecalis .
أ- 1% تربتون + 1% مستخلص خميرة .
ب- 1% تربتون + 1% مستخلص خميرة + 1% جلوكوز .
ج-1% تربتون + 1% مستخلص خميرة + 1% جلوكوز + 0.5% K2HPO4 .
د- 1% تربتون + 1% مستخلص خميرة + 0.1% جلوكوز + 0.5 K2HPO4 .
2- حضن لمدة 48 ساعة عند 37 ْم .
3- رج الأنابيب لتوزيع النمو جيداً ثم قارن العكارة الناتجة عن النمو بالنظر أو يمكن استخدام جهاز المطياف Spectrophotometer .
4- قس قيمة الرقم الهيدروجيني باستخدام الجهاز الخاص بذلك للتعرف على التغيير في الرقم الهيجروجيني في كل حالة .

نلاحظ أن النمو يختلف باختلاف الظروف التي تعرض لها الكائن . ففي الظرف الحالة الأولى يكون النمو قليل لعدم توفر مصدر الطاقة . أما في الحالة الثانية يكون النمو متوسط لتوفر مصدر الطاقة و عدم توفر منظم الحموضة . أما في الحالة الثالثة فنجد أن النمو يكون أفضل ما يمكن لتوفر الظروف الملائمة للنمو بشكل جيد . والحالة الأخيرة يكون النمو متوسط لقلة كمية مصدر الطاقة .

10- تأثير التهوية ( الأكسجين ) Oxygen effect :

تتطلب معظم الكائنات الدقيقة توفر الأكسجين للنمو والتكاثر وتعرف بالكائنات الهوائية إجبارياً Strict aerobes إلا أن بعضها الآخر يمكنه أن ينمو ويتكاثر في وجود أو غياب الأكسجين وتعرف بالكائنات الهوائية اختيارياً Facultative anaerobes كما أن هناك مجموعة أخرى من الكائنات لا تنمو نهائياً إذا وجدت في تركيزات ولو كانت منخفضة من الأكسجين وتعرف بالكائنات اللاهوائية اجبارياً Strict anaerobes كما توجد مجموعة أخرى تنمو في ضغط منخفض من الأكسجين وتسمى Microaerophilic .
وللأكسجين دور أساسي في استقبال الإلكترونات في تنفس الخلايا من خلال عمليات الأكسدة والإختزال .
وهناك عدة طرق لدراسة مدى حاجة البكتيريا للأكسجين ويمكن استخدام بعض هذه الطرق في عزل البكتيريا اللاهوائية في مزارع نقية وهذه الطرق :

(أ) طريقة الآجار العميق

خطوات العمل :
1- اغمس ابرة تلقيح مستقيمة معقمة في معلق مائي لتربة زراعية .
2- أوخز بها بيئة آجار الجلوكوز العميق , سبق إسالتها وتسخينها لمدة عشرة دقائق في حمام مائي عند 100 ْم لطرد الأكسجين المتخلل في البيئة , ثم تبريدها وتركها لتتصلب .
3- ضع الأنابيب بالحضان عند 37 ْم لمدة 48 ساعة ثم افحص الأنابيب ولاحظ النمو البكتيري الناتج على طول خط الوخز مستعيناً بالحالات المبينة بالشكل التالي :

( ب ) طريقة المرق المغذي والفاسبار Nutrient broth and faspar :

الفاسبار عبارة عن مادة خليط من شمع البرافين والفازلين ولها أهمية كبيرة في عزل الوسط الغذائي عن الهواء الجوي .
بحيث نقوم بتلقيح المرق المغذي المحتوي على 0.5 % آجار والموضوع في أنابيب بنوع من الأنواع البكتيرية ثم يغطى سطح الوسط الغذائي العلوي بطبقة من الفاسبار المعقم ويحضن عند درجة حرارة مناسبة . فإذا ظهر نمو للبكتيريا تكون هذه البكتيريا النامية من النوع اللاهوائي .

( ج ) طريقة مزارع الآجار المهتزة Shake culture method :

يحدد في هذه الطريقة موضع منطقة النمو في الأنبوبة كمقياس للإحتياجات الأكسجينية للميكروبات المدروسة .

1- أصهر ثلاثة أنابيب بيئة مستخلص الخميرة والتربتون أو بيئة الآجار المغذي ( آجار 0.5 % ) مضافاً لها الجلوكوز واحتفظ بها عند 100 ْم لمدة عشرة دقائق لطرد الأكسجين المذاب .
2- برد الأنابيب حتى 45 ْم ثم لقح كل منها بعدة غمسات من المزارع التالية E.coli , Micrococcus luteus , Clostridium perfringens . ثم أدر الأنابيب الملقحة برفق بين راحتيك لتوزيع اللقاح وذلك لمنع دخول الهواء داخل الآجار .
3- اترك الآجار ليتصلب ثم حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
4- تفحص الأنابيب لملاحظة النمو فإذا كان النمو في الأعلى فالبكتيريا هوائية إجبارية أما إذا كان النمو في الوسط فالبكتيريا لاهوائية اختيارية أما إذا كان النمو في قعر الأنبوب فتكون البكتيريا لاهوائية إجبارية .

( د ) طريقة البيروجالول Pyrogaloll method :

لتنمية بكتيريا غير هوائية على آجار مائل يمكن توفير جواً خالياً من الأكسجين داخل الأنبوبة بتفاعل كيميائي لمركب البيروجالول وهيدروكسيد الصوديوم أو كربونات الصوديوم والبيروجالول مادة اختزالية تزيل الأكسجين من الأنبوبة . وتجدر الإشارة عند استخدام طريقة أو أخرى لتنمية البكتيريا اللاهوائية تخليص الوسط المستخدم للزرع من الأكسجين بالتسخين كما في الطريقة السابقة ثم تغطية الوسط بعد الزرع بمادة تمنع إعادة الأكسجين للبيئة الزراعية مرة أخرى .
أو بإضافة مواد تختزل الأكسجين مثل الثيوجلايكولات الصوديوم ( HSCH2 COONa ) في الأوساط التي لايمكن تغطيتها . أو باستخدام وعاء معين يتم تفريغ الأكسجين منه وهو وعاء بريور brewer jar .

خطوات العمل :
1- لقح آجار جلوكوز مائل بمعلق التربة الزراعية السابق استعماله أو بالنمو غير الهوائي الناتج في قاع أنبوبة الآجار العميق أو يمكن تلقيح أربعة أنابيب كل واحدة بنوع من الأنواع البكتيرية التالية Clostridium sporogenes , B.subtilis , Clostridium rubrum , وتترك الأنبوبة الرابعة للمقارنة .
2- قص الزائد من السدادة القطنية لأنابيب الآجار المائل الملقحة بمقص ثم ادفع ما تبقى منها داخل الأنابيب حتى تصل إلى قرب حافة الآجار المائل .
3- أضف إلى الجزء العلوي من كل أنبوبة فوق السدادة القطنية كمية من مسحوق حمض البيروجاليك ثم أضف إليها كمية من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز 4% ثم اقفل الأنبوبة باحكام بسدادة مطاطية واقلب الأنبوبة مباشرة حتى لا يتسرب محلول الهيدروكسيد إلى سطح البيئة .
4- ضع الأنابيب وهي مقلوبة بالحضان عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
5- لاحظ نمو المستعمرات غير الهوائية .

( هـ ) طريقة بيئة مرق الثيوجلايكوليت Thioglycollate broth method :

تستعمل بيئة مرق الثيوجلايكوليت للتعرف على الميكروب المجهول ومدى حاجته للأكسجين وتحتوي هذه البيئة على جلوكوز وسيستين وثيوجلايكوليت الصوديوم لتقلل من كفاءتها التأكسدية الإختزالية وتحتوي على صبغة ريسازورين تكشف عن وجود الأكسجين بحيث تتخذ هذه الصبغة اللون الوردي في وجود الأكسجين وتكون عديمة اللون في غيابه . ولزيادة عزل البيئة عن الأكسجين تضاف كمية من الآجار على سطح النمو في الأنابيب المحتوية على البيئة

ملاحظة : يمكن استخدام وسائل أخرى للحصول على بكتيريا لاهوائية ومنها :
1- طريقة طبق بريورز : الذي يمتلك غطاءاً خاصاً يوفر جواً خالياً من الأكسجين وذلك بإضافة الثيوجلايكوليت

2- وعاء التفريغ الهوائي Gas jar system : وهو وعاء محكم الإغلاق يوضع بداخله مادة ماصة للأكسجين بحيث يصبح الهواء داخل الوعاء خال تماماً من الأكسجين .
3- أجهزة التفريغ للغازات : وهي أجهزة تحتوي على مخرج خاص يفرغ من خلاله الهواء الموجود بداخلها فيوفر داخل الجهاز جواً خالياً من الأكسجين .

وسنقوم هنا بتطبيق الفقرة ( د ) والطرق الأخرى ( طبق بريورز ووعاء تفريغ الهواء ) عملياً للتأكد من عزل الكائنات اللاهوائية فقط وذلك باستخدام نوع من البكتيريا الهوائية ونوع آخر من البكتيريا اللاهوائية .

طريقة العمل :
1- أسل أنابيب من آجار الجلوكوز ومستخلص الخميرة في حمام مائي واستمر بالتسخين عند 100 ْم لمدة 10 دقائق لطرد الهواء من البيئة , ثم برد الأنابيب حتى 45 ْم ولقح أحدها بـ Clostridium perfringens والآخر بالكائن Clostridium sporogenes ثم رج الأنابيب بحركة دائرية بين راحتيك لتوزيع اللقاح بشكل جيد . لقح الأنبوب الثالث بنوع من البكتيريا الهوائية مثل E.coli . ثم حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
2- لقح ثلاثة أنابيب من مرق الثيوجلايكوليت بعد غليانها وتبريدها كما سبق بكل من الأنواع السابقة ثم حضن .
3- لقح أنابيب من مرق الجلوكوز ومستخلص الخميرة بعد غليانها وتبريدها بالأنواع السابقة , ثم تتم تغطية أنبوبة من كل مجموعة بطبقة سمكها 2 سم من آجار معقم ( 5 % ) أو فاسبار مسال معقم ثم حضن .
4- خطط ثلاثة أطباق من الآجار المغذي بكل من الأنواع السابقة ثم ضعها في وعاء عزل الهواء وافتح كيس انتاج الهيدروجين وأضف إليه 10 مل ماء وضعه في الجهاز بسرعة ثم أغلقه بإحكام ( يمكن استخدام شمعة مشتعلة لسحب الأكسجين ) .
ثم حضن الجهاز عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .

نلاحظ بعد التحضين للخطوات السابقة ما يلي :
1- نلاحظ من الأنابيب في الخطوة رقم ( 1 ) أن النمو يكون مركزاً في قعر الأنابيب بشكل أكبر من المناطق الأخرى في الأنابيب نظراً لأن النوعين الأولين من البكتيريا لاهوائيين أما النوع الثالث فلا ينمو بسبب أنه هوائي .
2- نلاحظ من الخطوة الثانية والثالثة نمو البكتيريا اللاهوائية في بيئة الثيوجلاكوليت أما البكتيريا الهوائية فلا تنمو أما بالنسبة للأطباق فنلاحظ ما لاحظناه من نمو البكتيريا اللاهوائية وعدم نمو البكتيريا الهوائية .
ملاحظة : يمكن إضافة مجموعة أخرى من الأنابيب والأطباق دون معاملتها للتخلص من الأكسجين ( أي نحافظ على توفر الأكسجين في البيئة ) ثم نحقنها بالأنواع السابقة من البكتيريا ونحضنها في الظروف المعتادة للتحضين . ونلاحظ بعد عملية التحضين أن النوع البكتيري الهوائي ينمو بينما النوع اللاهوائي لا ينمو على العكس من الخطوات السابقة .

11- تأثير الجفاف The effect of desiccation :
الجفاف الشديد يؤثر بشكل كبير على النمو البكتيري واستمرار تكاثر البكتيريا وبما أن الماء مهم للبكتيريا لحصولها على غذائها في صورة ذائبة في الماء وعند جفاف الوسط تتوقف أنشطة التغذية مما يؤدي إلى موت الخلايا وهذا الجفاف أيضاً قد يؤثر على تغير بعض العوامل في الوسط وبالتالي يؤثر على حياة الخلية .

خطوات العمل :
1- عقم ثمانية أغطية شرائح بالتلهيب الكحولي عدة مرات ثم ضع كل أربعة منها في طبق بتري معقم .
2- انقل نقطة صغيرة من مزرعة بكتيريا E.coli بعمر 24 ساعة إلى مركز أغطية الشرائح في أحد الأطباق , وانقل نقطة صغيرة من مزرعة Bacillus subtilis بعمر 72 ساعة إلى مركز الأغطية في الطبق الآخر .
3- ضع الأطباق في الحضان واترك النقط تجف داخل الطبق .
4- انقل غطاء شريحة واحد بعد أن يجف باستخدام ملقط معقم إلى طبق بتري معقم ثم صب عليه كمية من بيئة الآجار المغذي
5- ضع الأطباق بالحضان على درجة 37 ْم .
6- اترك باقي الأغطية في أطباقها بداخل الحضان لمدة 48 ساعة ثم كرر العملية كل 48 ساعة .
7- احسب عدد المستعمرات التي تظهر على سطح بيئة الآجار لكل غطاء لتحديد تأثير فترة الجفاف على الخلايا البكتيرية .