تخمر الكربوهيدرات داخل الكائنات الدقيقة , Carbohydrates fermentation

تختلف البكتيريا اختلافاً كبيراً في قدراتها التخمرية للمواد الكربوهيدراتية فبعضها يمكنه أكسدة السكريات البسيطة مكوناً حمض مثل حمض اللاكتيك والخليك والسكسينيك والفورميك وغاز مثل ثاني أكسيد الكربون والهيدروجين والميثان والبعض الآخر يخمر نفس السكر وينتج حمض فقط .
ويعتمد نوع المركبات المنتجة حسب نوع الميكروب وكذلك نوع السكر المستخدم .
والبعض الآخر لا يمكنه تخمير السكر نهائياً . وتعتبر خاصية تخمير السكريات وبعض المواد الهيدروكربونية من الصفات الهامة للتعرف على البكتيريا وتصنيفها .
ويمكن استخدام أنابيب تسمى أنابيب درهام Durham tubes أو بوضع طبقة من الفاسبار على سطح البيئة السائلة لدراسة تكون الغاز أما البيئة الصلبة فيعرف ذلك من تشقق طبقة الآجار. واستخدام دليل مثل الفينول الأحمر أو بروموثيمول بلو الذي يتغير لونه في حال تكون الحمض بفعل تخمر الكربوهيدرات .
ويمكن دراسة هذه الظاهرة بعدة طرق :
دراسة تكون الحمض والغاز : ويمكن دراستها بطريقتين :

الطريقة الأولى :

( أ ) خطوات العمل :
1- حضر مزارع حديثة النمو بعمر 24 ساعة نامية على بيئة آجار مغذي للأنواع التالية من البكتيريا E.coli , Bacillus subtilis , Pseudomonas marginata .
2- حضر أنابيب درهام محتوية على 9 مل من بيئة تخمر السكريات المكونة من مصدر نيتروجيني غير عضوي مع دليل أزرق بروموثيمول Promo thymol blue أو من بيئة تخمر السكريات المكونة من مصدر نيتروجيني عضوي مضافاً إليها دليل بروموكريزول الأرجواني Brom cresol purple كما وتعرف هذه البيئة المرق القرمزي القاعدي Purple broth base .
3- حضر محاليل بتركيز 2% من السكريات التالية مع تعقيمها بالترشيح أو باستعمال التعقيم البخاري المتقطع خاصة مع السكريات الثنائية
أرابينوز – جلوكوز – لاكتوز – سكروز – مالتوز .
4- أضف إلى البيئة بكل أنبوبة 1مل من محلول السكر المعقم والمراد اختبار تخمره ليصبح تركيز السكر بالبيئة 0.2 % .
5- لقح أنبوبتين من كل سكر من المزرعة المراد اختبارها .
6- ضع الأنابيب بالحضان عند 30 ْم لمدة أسبوع أو أكثر .
7- افحص الأنابيب كل 48 ساعة مع ملاحظة تغير لون البيئة إلى اللون الأصفر عند تكون الأحماض وتجمع فقاعات غازية في أنابيب درهام الصغيرة الداخلية عندما تتكون غازات.

( ب ) خطوات العمل :
1- حضر أربعة أنابيب من البيئات التالية :
1- مرق الجلوكوز وأحمر الفينول المحتوية على أنبوبة درهام .
2- مرق السكروز وأحمر الفينول المحتوية على أنبوبة درهام .
3- مرق اللاكتوز وأحمر الفينول المحتوية على أنبوبة درهام .
لقح الأنابيب بإحدى أنواع البكتيريا ( كل نوع ثلاثة أنابيب ) E.coli , Proteus vulgaris , Streptococcus faecalis واترك الأنابيب للمجموعة الرابعة دون تلقيح للمقارنة .
2- باستخدام مزرعة من بكتيريا E.coli لقح أنبوبة من بيئة مرق الجلوكوز وأحمر الفينول
وغط البيئة بطبقة الفاسبار .
1- بعد التحضين عند 37 ْم لمدة 48 ساعة افحص الأنابيب باحثاً عن تكون الغاز والحمض في الأنابيب ( يظهر الغاز كفراغ في أنبوبة درهام المقلوبة أو تشقق في أنبوبة الفاسبار أما الحمض فيظهر بتغير اللون للوسط نتيجة تغير الحامضية للوسط ) .

الطريقة الثانية : استخدام الأقراص المشبعة بالكربوهيدرات .

توضع الأقراص المشبعة بالكربوهيدرات المراد دراستها على سطح بيئة أحمر الفينول التي سبق تلقيحها بالميكروب المدروس وينتشر السكر من القرص إلى الآجار المحيط به ويلاحظ تخمر السكر بتكون هالة صفراء حول القرص .

خطوات العمل :
1- لقح أطباق آجار أحمر الفينول بأنواع البكتيريا التالية :
E.coli , Enterobacter aerogenes , Pseudomonas aeroginosa , Proteus
Vulgaris . انشر اللقاح على سطح كل طبق بمرود معقم Swab أو ساق زجاجي منثن
2- عقم ملقط ثم وزع باستخدامه ستة أقراص من الكربوهيدرات على سطح الآجار بانتظام .
3- حضن الأطباق لمدة 18 – 24 ساعة عند 37 ْم دون أن تقلب ثم افحص أقراص
الكربوهيدرات في الأطباق باحثاً عن تغير لون أحمر الفينول إلى اللون الأصفر نتيجة
عملية التحلل للسكر .
4- أعد التحضين ثم افحص بعد 48 ساعة وهذه الفترة الثانية ضرورية حيث أن الميكروبات المختلفة لا تخمر الكربوهيدرات بنفس السرعة .
ملاحظة : تعتمد نتائج هذه التجربة على العوامل التالية :
1- اختلاف سرعة الميكروب على تخمر السكر .
2- أكسدة الحمض المتكون حيث أن الحمض المتكون من عملية التخمر يمكن أن يتأكسد مما يؤدي إلى اختفاء اللون المتكون وعلى ذلك قد تتغير هذه النتيجة لتعطي وسطاً قاعدياً بعد 48 ساعة عندها قد يكون بداية تخمر مادة سكرية أخرى قد بدأ .

الطريقة الثالثة : بيان ما إذا كان استهلاك الكربوهيدرات بالتخمر أم بالأكسدة .

خطوات العمل :
1- من مزارع البكتيريا التالية E.coli , Pseudomonas aeroginosa لقح أنبوبتين من
بيئة آجار الجلوكوز O.F Oxidation fermentation ) بيئة التخمر والأكسدة )
بالوخز بإبرة تلقيح مستقيمة .
2- غط أنبوبة من كل مزرعة بطبقة رقيقة من الفاسبار .
3- حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .
4- افحص لتكون الحمض والغاز من تخمر سكر الجلوكوز .
ملاحظة : المزارع التي حدث فيها تخمر للسكر سوف يتحول اللون لكلتا الأنبوبتين من اللون القرمزي إلى اللون الأصفر نتيجة تكون الأحماض , أما المزارع التي حصل فيها تأكسد للسكر فسوف يتحول سطح الأنبوبة غير المغطاة فقط إلى اللون الأصفر أما بقية الأنبوب لن يحدث له أي تغير .
الطريقة الرابعة : استخدام دليل bromothymol blue :

يعطي هذا الدليل لوناً أصفر في حال تكون الحمض بسبب تخمر السكر الموجود في الوسط الغذائي ويكون أزرق اللون في الوسط القاعدي كما ويتم التعرف على إنتاج الغاز من عملية التخمر بظهور غاز في الأنابيب المقلوبة .
خطوات العمل :
1- احقن أنابيب محتوية على أنابيب درهام بداخلها مرق مغذي محتو على سكر الجلوكوز بالأنواع التالية من البكتيريا Sarcina , Staphylococus , Bacillus , E.coli .
2- كرر الخطوة السابقة بحقن الأنابيب بنفس الأنواع من البكتيريا مع تغيير نوع السكر في الوسط الغذائي إلى اللاكتوز .
3- كرر الخطوة السابقة بحقن الأنابيب بنفس الأنواع من البكتيريا مع تغيير نوع السكر في الوسط الغذائي إلى السكروز .
4- حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة .

https://lh5.googleusercontent.com/-aGyMo87UUoI/T-8L0MxJBII/AAAAAAAAAu0/QLNqN7uWVck/s512/%25D8%25B5%25D9%2588%25D8%25B1%2520%25D8%25AA%25D8 %25B7%25D8%25A8%25D9%258A%25D9%2582%25D9%258A%25D8 %25A9%2520025.jpg https://lh3.googleusercontent.com/-WPOTZBIxUfE/T-8MIFkzBwI/AAAAAAAAAvA/XpdXlE12kQA/s512/%25D8%25B5%25D9%2588%25D8%25B1%2520%25D8%25AA%25D8 %25B7%25D8%25A8%25D9%258A%25D9%2582%25D9%258A%25D8 %25A9%2520036.jpg

الكشف عن بعض المواد الهامة الناتجة عن تخمر السكريات :

اختبار فوجس بروسكاور- أحمر الميثايل Methyl Red-Voges Proskauer Test
تختلف أنواع البكتيريا في ناتج تخمرها للسكريات البسيطة فبعضها تنتج أحماضاً وبعضها يكون الكحولات وبعضها مواداً متعادلة . فمثلاً بكتيريا E.coli تكون حمض البيروفيك كمادة وسطية لتخمر الجلوكوز ثم يتكون منه حمض الخليك وكلا الحمضين يتحللان إلى ثاني أكسيد الكربون وغاز الهيدروجين . وقد ينتج منهما أنواع أخرى من الأحماض .
فيكون ناتج التخمر للجلوكوز أحماض وغازات وأحياناً بعض الكحولات , أما في حالة بكتيريا Aerobacter aerogenes يحدث تكثيف لجزيئين من حمض البيروفيك مع إزالة جزيئين من ثاني أكسيد الكربون مكوناً مركباً متعادلاً هو الأسيتايل ميثيل كربينول acetyl methyl carbinol وبذلك يكون اختبار فوجس بروسكاور يجرى للكشف عن مادة الأسيتايل ميثيل كربينول فإذا وجدت هذه المادة يكون الإختبار موجب ويرمز له V.P+ وإذا لم توجد يكون الإختبار سالب V.P- في حين أن اختبار أحمر الميثايل يجرى لاختبار تكوين أحماض عضوية ففي حال وجود هذه المواد يكون الإختبار موجب ويرمز له M.R+ وفي حال عدم وجودها يكون الإختبار سالب M.R- .
ويستخدم هذا الإختبار بغرض التعريف والتصنيف لأنواع من البكتيريا وخاصة بكتيريا القولون .

خطوات العمل :
1- حضر مزرعة حديثة بعمر 24 ساعة من بكتيريا E.coli , Aerobacter aerogenes
2- حضر ثلاثة أنابيب من بيئة فوجس بروسكاور- أحمر الميثايل MR-VP.
3- لقح أنبوبة بكل مزرعة مع ترك الأنبوبة الثالثة بدون تلقيح للمقارنة .
4- ضع الأنابيب بالحضان عند 30 ْم لمدة 48 ساعة .
5- بعد التحضين يتم الكشف عن مادة الأسيتايل ميثيل كربينول بنقل1 مل من المزرعة إلى أنبوبة نظيفة ثم أضف إلى الأنبوبة 0.5 مل من محلول باريت ( أ) Barritt A ( 0.3 % كرياتين + KOH 40 % ) و 0.5 مل من محلول باريت (ب) Barritt B ( -Naphthol ά ) , رج محتويات الأنبوبة واتركها معرضة للهواء لمدة 5 – 15 دقيقة لاحظ تكون لون أحمر وردي دلالة على وجود هذه المادة .
6- اكشف عن تكون أحماض بالمزرعة وذلك بإضافة عدة نقط من دليل أحمر الميثايل إلى ما تبقى من المزرعة لاحظ تكون لون أحمر غامق دلالة على أن الإختبار موجبا وظهور اللون الأصفر يدل على أن الإختبار سالب .

اختبار تكون حمض البيوتيريك :

بعض أنواع البكتيريا يتميز بإحداث تخمر للسكريات منتجة حمض البيوتيريك Butyric acid مع بعض المواد الأخرى , وعادة يتم إنتاج هذا الحمض في الظروف اللاهوائية مثل بعض الأنواع من بكتيريا اللبن تسبب تخمراً مماثلاً يعرف بالتخمر البيوتيري .

خطوات العمل :
1- حضر أنابيب من بيئة لبن الفرز المضاف إليه البروموكريزول الأرجواني .
2- لقح أنبوبة من مزرعة حديثة من بكتيريا Clostridium butyricum وأنبوبة أخرى ببكتيريا E.coli . احتفظ بأنبوبة ثالثة دون تلقيح للمقارنة .
3- أضف إلى كل أنبوبة كمية قليلة من مسحوق كربونات الكالسيوم .
4- صب كمية كافية من مزيج فاسبار المنصهر فوق سطح البيئة ثم اترك الأنابيب في وضع قائم ليتصلب مزيج فاسبار.
5- ضع الأنابيب بالحضان عند 30 ْم لمدة 2-4 أيام .
6- تخلص من طبقة الفاسبار وذلك بتسخين الأنبوبة قليلاً مقابل المزيج المتصلب ثم انزع الكتلة المتصلبة بواسطة ابرة التلقيح .
7- لاحظ لون ورائحة البيئة . تغير لون الدليل إلى اللون المصفر . وظهور رائحة تشبه رائحة الزبد المتزنخ دلالة على وجود حمض البيوتيريك .

اختبار تكوين كحول الإيثايل :

قد يمثل كحول الإيثايل وثاني أكسيد الكربون أهم ناتج لتخمر السكريات عن طريق بعض الكائنات الحية الدقيقة مثل الخميرة . أو قد يكون واحداً من النواتج العديدة لتخمر السكريات بواسطة كثير من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مثل بعض أنواع البكتيريا كبكتيريا القولون .
وتستغل هذه الظاهرة في بعض الصناعات الغذائية كإنتاج المشروبات الكحولية وإنتاج الكحول .

خطوات العمل :
1- حضر مزارع عمرها أسبوع من الكائنات الحية التالية :
Saccharomyces cerevisiae , E.coli النامية في بيئة مرق خلاصة المالت .
2-اختبر في المزرعة وجود كحول الإيثايل بنقل 5 مل من المزرعة ( مع عدم رج المزرعة) إلى أنبوبة نظيفة .
3- أضف إليها أربع نقط من محلول هيدروكسيد الصوديوم 10% ثم أضف عدة نقط من محلول اليود المركز ولاحظ تكون راسب أصفر من اليود في حالة وجود كحول الإيثايل وإذا لم يتكون الراسب مباشرة يمكن تسخين المخلوط إلى درجة 60 ْم لمدة 15 دقيقة , إذا لم يتكون الراسب فإن ذلك دليل على غياب كحول الإيثايل من المزرعة .