اشكال الخلايا البكتيرية عملياً الصبغ البسيط , Simple staining

وأول خطوة في فحص ومعرفة أشكال الخلايا البكتيرية هي : عمل الغشاء البكتيري وتثبيته أي أن تلتصق الخلايا البكتيرية على الشريحة التي ستصبغ عليها حتى لا تزول الخلايا عن الشريحة أثناء الصبغ وهذه العملية أي تثبيت الغشاء البكتيري تكون عامة وأساسية في معظم عمليات الصبغ المستعملة للبكتيريا . ثم القيام بصبغ الغشاء البكتيري حيث أن الخلايا البكتيرية غير المصبوغة يصعب رؤيتها تحت المجهر بوضوح لأنها عادة تكون شفافة ولذلك نلجأ إلى استخدام صبغات خاصة لتسهيل الرؤية وتمييز الخلايا .
وحيث أننا سنستخدم نوع واحد من الصبغات فنسمي هذه العملية بالصبغ البسيط , وتختلف الصبغات في سرعة ارتباطها بالخلية حسب سرعة تفاعل أيون الصبغة مع الخلايا ومن هذه الصبغات ما هو قاعدي مثل أزرق الميثيلين والكريستال البنفسجي والكربول فوكسين ومنها ما هو حمضي مثل السفرانين والأيوسين والنجروسين .
وتجدر الإشارة إلى أن هناك طرق تعتمد الصبغ المباشر للخلايا البكتيرية ومنها طرق غير مباشرة تعتمد على صبغ محيط الخلية . وسنذكر هنا بعض هذه الطرق المهمة والمستخدمة بكثرة في هذا المجال .

المواد والأدوات اللازمة :
الأطباق المزروعة مسبقاً – شرائح زجاجية فارغة – إبر تلقيح ذات العقدة – صبغة أزرق الميثيلين Methylene blue و السفرانين Safranin – حامل شرائح – حوض صباغة – لهب – مجهر – زيت العدسات(السيدر) – ماء مقطر.

خطوات العمل :
1- نضع قطرة من الماء في منتصف شريحة زجاجية نظيفة.
2- باستخدام الإبرة ذات العقدة المعقمة نأخذ مسحة بسيطة من أحد المستعمرات البكتيرية من الأطباق المتوفرة ثم نخلطها مع قطرة الماء ثم نفردها جيداً مع ملاحظة عدم تكون غشاء سميك على الشريحة الزجاجية حتى نتمكن من رؤية الخلايا بصورة واضحة. أما بالنسبة للبيئات السائلة فنأخذ غمسة من كل أنبوبة ونفردها على شريحة نظيفة .
3- نجفف الشريحة بتعريضها للهب على مسافة 25 سم فوق اللهب حتى تجف تماماً مع مراعاة أن تكون الشريحة دافئة حتى لا يحدث تكسر وتشوه للخلايا . وتعرف هذه العملية (تثبيت الغشاء البكتيري). ويمكن تحضير أكثر من شريحة لصبغها بصبغات مختلفة وملاحظة الفرق بينها.
4- باستخدام حوض الصباغة نضع الشرائح على الحامل فوق الحوض ونغطي الغشاء بصبغة أزرق الميثيلين ( تسمى بطريقة لويفلر ) وآخر بالسفرانين لمدة 30 ثانية ويمكن استخدام صبغتي الكريستال البنفسجي والكربول فوكسين لمدة 10 ثوان.
5- نسكب الصبغة في الحوض ثم نغسل الشريحة جيداً بالماء المقطر.
6- نجفف الشريحة جيداً باللهب أو بورق النشاف وتعرف هذه الخطوات بـ (الصبغ البسيط ).
7- نضع على الشريحة قطرتين من زيت العدسات ونفحص تحت المجهرباستخدام العدسة الزيتية كما ذكر سابقاً.
8- ندون النتائج التي نحصل عليها من حيث شكل الخلايا وحجمها وتجمع الخلايا.

ملاحظة : يمكن استخدام مزارع بكتيرية معروفة النوع للتأكد من الحصول على الأشكال البكتيرية المختلفة مثل Staphylococcus , Bacillus sp.
وبعد تطبيق العمل بشكل جيد نجد بالفحص ظهور خلايا مختلفة الأشكال مصبوغة باللون الأزرق عند استخدام أزرق الميثيلين أو باللون الأحمر عند الصبغ بالسفرانين .