إنزيمات الأكسدة , التنفس , Oxidation enzymes , الإختبارات الفسيولوجية للبكتيريا

دراسة إنزيمات الأكسدة ( انزيمات التنفس ) في البكتيريا Oxidation enzymes ( الإختبارات الفسيولوجية للبكتيريا)

إن عمليات الأكسدة البيولوجية مهمة للكائن الحي للحصول على الطاقة و تعتمد هذه العملية على وجود إنزيمات تعمل على نزع الهيدروجين Dehydrogenases والإلترونات وتكون هذه الإنزيمات قادرة على تنشيط الهيدروجين بمادة التفاعل بحيث تجعلها قابلة للتاكسد هوائياً في وجود الأكسجين وتعرف في هذه الحالة بالتنفس أو الأكسدة الهوائية أو تحدث هذه العملية في غياب الأكسجين بوجود مواد قابلة للإختزال سواءاً كانت مواد عضوية أو غير عضوية وتعرف هنا بالتخمر أو الأكسدة اللاهوائية .
ومن هذه المواد القابلة للإختزال :

اختزال صبغة أزرق الميثيلين .

يكون لون هذه الصبغة أزرقاً في حالتها المؤكسدة وتصبح عديمة اللون عند استقبالها للهيدروجين ( عند اختزالها ) وسرعة تغير اللون يدل على سرعة عمليات الأكسدة في المزرعة , لذلك يجب عزل المزرعة المضاف لها صبغة أزرق الميثيلين عن الهواء لعدم أكسدتها بوجود الهواء الجوي .

خطوات العمل :
1- حضر مزرعة حديثة من بكتيريا E.coli نامية على بيئة الآجار المغذي .
2- اعمل معلق بكتيري من المزرعة في 10 مل من الماء المقطر المعقم .
3- حضر في أنبوبين ما يلي : 1 مل من محلول 1% سكر جلوكوز , 1 مل محلول 0.01 % من أزرق الميثيلين , 1 مل من محلول منظم فوسفاتي 7 ph .
4- أضف إلى أحد الأنابيب 1 مل من معلق الخلايا و 1 مل من ماء مقطر في الأنبوب الثاني
5- ضع 2 مل من زيت بارافين معقم فوق المخلوط بعد رجه للتخلص من فقاعات الهواء .
6- ضع الأنابيب في حمام مائي عند 37 ْم , ثم احسب الوقت اللازم لاختفاء لون الصبغة في الأنبوب الأول .

2- اختزال فوق اكسيد الهيدروجين أو اختبار الكاتاليز Catalase test.

أثناء عمليات الأكسدة الهوائية قد تتكون مادة فوق أكسيد الهيدروجين H2O2 نتيجة تفاعل الهيدروجين المنفصل من مواد التفاعل أو من المواد الوسطية في عمليات الأكسدة مع الأكسجين الجوي .
وحيث أن هذه المادة ذات تأثير سام للخلايا فإن الخلايا البكتيرية الهوائية تنتج إنزيم الكاتاليز Catalase الذي يعمل على اختزال فوق أكسيد الهيدروجين ويحوله إلى ماء وينطلق غاز الأكسجين لذلك فالبكتيريا اللاهوائية تتسمم عند تعرضها للهواء الجوي .
ويوجد إنزيم الكاتاليز في أغلب البكتيريا الهوائية لتتمكن من تحليل فوق أكسيد الهيدروجين لذا فهي تعطي نتيجة إيجابية عند الكشف عنه أما البكتيريا اللاهوائية فتعطي نتيجة سالبة لهذا الإختبار .

ويعتير هذا الإختبار من الإختبارات المهمة في تصنيف البكتيريا .

الطريقة الأولى :

خطوات العمل :
1- حضر مزرعة حديثة بعمر 24 ساعة وأخرى قديمة بعمر أسبوعين نامية على بيئة آجار مائل لكل من البكتيريات التالية : Staphylococcus aureus , Streptococcus faecalis .
2- لقح أنبوبة من آجار مستخلص الخميرة المائل وأخرى من مرق مستخلص الخميرة لكلا النوعين .
3- حضن عند 37 ْم لمدة 24 – 48 ساعة .
4- اغمر سطح المزرعة بكل أنبوبة بكمية كافية من محلول 3% من فوق أكسيد الهيدروجين H2O2 ولاحظ درجة تصاعد الفقاعات نتيجة تصاعد غاز الأكسجين وذلك دلالة على وجود إنزيم الكاتاليز فإذا كان خروج الفقاعات مباشرة كان اختباراً موجباً قوياً أما إذا أعطى نتيجة خلال 3 دقائق فيكون موجباً ضعيفاً أما بعد 3 دقائق فيكون الإختبار سالباً .
Catalse test -اختبار الكاتاليز

الطريقة الثانية :

خطوات العمل :
1- خطط طبق من بيئة آجار الدم ببكتيريا Streptococcus faecalis وآخر ببكتيريا Staphylococcus aureus .
2- حضن الطبقين عند 37 ْم لمدة 24 ساعة .
3- خذ بأنبوبة شعرية كمية من فوق أكسيد الهيدروجين H2O2 3% ثم المس بالأنبوبة الشعرية كلا المزرعتين فإذا تكون فقاعات دل ذلك على أن الميكروب منتج لإنزيم الكاتاليز .
لاحظ الصورة في الأعلى .

3- اختزال النيتريت Reduction of Nitrates .

كثير من أنواع البكتيريا لها القدرة على اختزال النترات إلى نيتريت وبعضها يمكنها اختزال النيتريت بفعل إنزيم النيتراتيز Nitratase إلى أمونيا .
والنترات والنيتريت تعتبر من المواد المساعدة في عمليات الأكسدة غير الهوائية بحيث تستخدم كمستقبلات للهيدروجين عند تحولها إلى أمونيا لذلك تعتمد عملية اختزال النترات والنيتريت على عدم توفر التهوية للمزرعة وكذلك على تركيز أيون الهيدروجين في البيئة بحيث تختزل النترات إلى نيتريت في البيئة القلوية وتصل عملية الإختزال إلى الأمونيا في حالة البيئة عالية الحموضة ويعتبر هذا الإختبار من الإختبارات المهمة في التصنيف للبكتيريا .

خطوات العمل :
1- جهز مزرعة حديثة بعمر 24 ساعة من بكتيريا E.coli , Bacillus subtilis .
2- لقح بكل من المزارع السابقة أنبوبة من بيئة مرق النترات ( N.B محتوية على نترات الصوديوم 0.1 % ولابد من خلو البيئة من السكريات ) واترك أنبوبة بدون تلقيح للمقارنة .
3- حضن الأنابيب عند 30 ْم لمدة 48 ساعة ثم اكشف عن النيتريت والأمونيا في المزارع بعد التحضين كما يلي :
للكشف عن النيتريت : انقل 3 مل من المزرعة في أنبوبة نظيفة ثم أضف إليها 1 مل من محلول السلفانيليك Sulfanilic acid ثم 0.5 مل من محلول ألفانفثايل أمين ά-Naphthyle amine فإذا ظهر في الأنبوبة لون أحمر وردي هو صبغة الآزو الحمراء دل ذلك على وجود النيتريت .
وهناك طريقة أخرى للكشف عن النيتريت وذلك بإضافة قليل من حامض خليك 33% ومسحوق الثيويوريا ومحلول كلوريد الحديديك 10% إلى 2 مل من المزرعة فإذا تكون لون أحمر طوبي من ثيوسيانات الحديديك دل ذلك على وجود النيتريت .
للكشف عن الأمونيا : يستعمل محلول نسلر كما في التمرين السابق ( الكشف عن الأمونيا ) .

نشاط الأكسيديز Oxidase activity :
يتم اختبار الأكسيديز بقياس قدرة الميكروب على أكسدة بعض الأمينات العطرية مثل بارا أمينوداي ميثايل أنيلين لتكون مواد ملونة وذلك بتأثير إنزيم السيتوكروم أكسيديز , ويعد هذا الإختبار من الإختبارات المعرفة لبعض أجناس البكتيريا مثل بكتيريا Pseudomonas , Neisseria والبكتيريا المعوية التي تتميز بأنها سالبة لهذ الإختبار .
ويتم إجراء هذه التجربة بعدة طرق :
الطريقة الأولى :

خطوات العمل :
1- لقح في أنابيب محتوية على بيئة مرق الجليسرول أنواع مختلفة من البكتيريا مثل E.coli Pseudomonas fluorescence .
2- حضن الأنابيب عند 30 ْم لمدة 48 ساعة .
3- أضف إلى المزرعة النامية في بيئة مرق الجليسرول 1 مل من محلول مائي من الباراأمينوفينول 0.4% .
عند ظهور لون بني خلال 10 دقائق يدل على أن الإختبار موجب .
الطريقة الثانية :
خطوات العمل :
1- لقح في أنابيب محتوية على بيئة مرق مغذي أنواع مختلفة من البكتيريا مثل E.coli Pseudomonas fluorescence .
2- حضن الأنابيب عند 30 ْم لمدة 48 ساعة .
3- أضف إلى المزرعة النامية في بيئة المرق المغذي 1 مل من محلول مائي من di-methyl-p-phenylendiamine و 1 مل من دليل ά-naphthol .
عند ظهور لون أزرق نتيجة تفاعل الدليلين مع إنزيم الأكسيديز خلال دقيقتين يدل على أن الإختبار موجباً أما إذا زاد عن الدقيقتين فلا يعتد بهذه النتيجة لأن الدليل أيضاًً سيعطي لوناً أزرقاً لعدم ثباته .

اختبار الكواجيوليز Coagulase test :
يستخدم هذا الفحص للتفريق بين أنواع البكتيريا العنقودية الممرضة وغير الممرضة إذ يعتبر انتاج هذا الإنزيم دلالة على وجود بكتيريا Strep.aureus الممرضة .
ويتم إجراء هذا الإختبار بطريقتين :
باستعمال شريحة زجاجية أو باستعمال أنبوب اختبار صغير من خلال اجراء تفاعل بين البكتيريا وبلازما الدم فإذا حدث تخثر للبلازما دل ذلك على أن الإختبار موجب .
نضع 0.5 مل من البلازما المخففة مع 5 مل من معلق البكتيريا المراد فحصها ثم توضع في حضان عند 37 ْم لمدة 30 – 60 دقيقة ثم نلاحظ التخثر .

التفاعل الحاصل على بيئة آجار الحديد الثلاثي Triple sugar iron agar ( T.S.I )
يستخدم للتعرف على بعض أنواع البكتيريا المعوية المنتجة لكبريتيد الهيدروجين وانتاج حمض أو قلوي أو غاز وذلك لاحتوائه على ثلاثة أنواع من السكريات .

طريقة العمل :
1- حضر أنابيب مائلة من بيئة T.S.A ( أربعة أنابيب ) ولقحها بأربعة أنواع مختلفة من البكتيريا ( بكتيريا معوية ) .
2- حضن الأنابيب عند 37 ْم لمدة 48 ساعة . ثم خذ النتائج .

– يتخمر سكر الجلوكوز فقط فيعطي الجزء العلوي من الأنبوب بلون أحمر والجزء السفلي ( السميك ) بلون أصفر .
– إذا كان اللون أصفر في الأنبوب دل ذلك على تخمر السكريات جميعها في البيئة .
– ظهور اللون الأسود يدل على انتاج كبريتيد الهيدروجين .
– وجود غاز يظهر على شكل فقاعات في الأنبوب .