عزل البكتيريا من بيئات مختلفة , Microbes in the Environment

تمـهـيد :

إن الكائنات الحية الدقيقة توجد في جميع الأوساط البيئية المحيطة بنا في المياه وفي التربة وفي الهواء وعلى أجسام الكائنات الحية الأخرى وداخلها وكذلك توجد في كل مكان يتوقع عدم وجودها فيه ومعظم هذه الكائنات غير مسببة للضرر وبعضها يسبب الأضرار والأمراض للكائنات الحية الأخرى كالإنسان والحيوان والنبات وبعضها يكون مفيدا.ً وبالرغم من ذلك يجب أخذ الحيطة والحذر أثناء التعامل مع هذه الكائنات داخل المعمل ويمكن عزل الكثير من أنواع البكتيريا و الفطريات الموجودة في الأوساط المحيطة بنا ولكن الفطريات بصورة أبطأ وسنورد ذلك في جزءٍ خاص بذلك و سنقوم في هذا الدرس بعزل البكتيريا من الهواء وماء الصنبور والتربة والشعر والجلد والحلق إثباتاً لوجود البكتيريا في كثير من الأوساط البيئية المحيطة بنا .

المواد والأدوات اللازمة :
بيئة الآجار المغذي المسال – أنابيب اختبارمعقمة- أطباق بتري – ماء مقطر ومعقم- ماصات معقمة- تربة – ماسحات طبية معقمة – لهب- حامل أنابيب- ميزان.

خطوات العمل:
أولا: عزل بكتيريا الهواء :
1- نحضر أطباق بتري ونصب بها 20 ملل من بيئة الآجار المغذي المحضرة مسبقا ونتركها لكي تتصلب .
2- نأخذ طبقين ونعرض أحدها إلى هواء المعمل والآخر إلى الهواء الخارجي وذلك لمدة 10 دقائق .
3- نضع الطبقين في الحضان عند 37 ْم لمدة تتراوح بين 24- 48 ساعة .
4- نأخذ النتائج التي نحصل عليها ونسجلها .

ثانيا: عزل البكتيريا من ماء الصنبور:
نحصل على عينة ماء الصنبور بفتح الصنبور لمدة دقيقتين ثم أخذ عينة الماء بملء علبة معقمة ذات سدادة لضمان عدم تلوث مياه الصنبور من مصدر آخر .

1- باستخدام ماصة نظيفة ومعقمة نأخذ بضع قطرات من ماء الصنبور وتحت اللهب .
2- نفتح غطاء طبق بتري إلى النصف بالقرب من اللهب ونضع قطرات الماء في منتصف الطبق .
3- نصب الوسط الغذائي السائل في الطبق ونغلقه مع الحرص على تعقيم فوهة الدورق باللهب قبل غلقه ثم نحرك الطبق حركة دائرية تارة مع عقارب الساعة وأخرى عكس عقارب الساعة وذلك لخلط العينة مع الوسط الغذائي .
4- نترك الوسط الغذائي في الطبق حتى يتصلب ثم نضعه في الحضان عند 37 ْم لمدة 24-48 ساعة.
5- نأخذ النتائج وندونها.
** يمكن أن نستخدم طريقة أخرى في عملية العزل بأن نأخذ طبق بتري به وسط غذائي متصلب ونضع القطرات عليه ثم ننشرها بواسطة ماسحة قطنية معقمة.
ثالثا: عزل بكتيريا التربة :

1- نعمل تخفيفات لعينة التربة وذلك باستخدام خمسة أنابيب معقمة ومحتوية على 9ملل من الماء المقطر المعقم أو محتوية على محلول منظم معقم مثل محلول الفوسفات المنظم phosphate buffer solution ( كما يمكن استخدام دوارق أو زجاجات لهذه الطريقة وبأحجام مختلفة وذلك بحسب الكمية التي يمكن اخذها وتخفيفها من العينة ) .
2- نوزن 1 جم من التربة باستخدام الميزان ( يمكن استخدام هذه الطريقة للعينات السائلة مثل الحليب والمياه وغيرها كما سنورد لاحقاً مع الأخذ بعين الإعتبار أنه يستخدم 1مل من العينة بدلاً من 1جم ) و نضعه في الأنبوب الأول تحت ظروف التعقيم لعمل تخفيف للتربة ويكون التخفيف 1/10.
3- نأخذ باستخدام ماصة معقمة 1 ملل من الأنبوب الأول ونضيفه إلى الأنبوب الثاني فيصبح به 10 ملل ويكون تركيزه 1/100.
4- نكرر العملية مع الأنبوب الثالث فيصبح تركيزه 1/1000.
5- نكرر العملية مع الأنبوب الرابع فيصبح تركيزه 1/10000.
6- نكرر العملية مع الأنبوب الخامس فيصبح تركيزه 1/100000 .
7- نأخذ من الأنابيب الثلاثة الأخيرة بضع قطرات من كل أنبوب ونضعها في ثلاثة أطباق ونكرر الخطوات كما في عزل بكتيريا الماء.

** يجب التأكد من كتابة المعلومات على الأطباق باستخدام قلم خطاط لكي لا تختلط الأطباق ببعضها كما ويمكن زيادة مرحلة التخطيط إذا كانت العينة محتوية على عدد كبير من الخلايا البكتيرية .

رابعاً: عزل بكتيريا الشعر والجلد والحلق :

نحضر ثلاثة أطباق بتري ونصب بها 20 ملل من الآجار المغذي ونتركها حتى تتصلب ثم نقوم بما يلي :
1- الطبق الأول نضع في منتصفه شعرة من الرأس تحت اللهب .
2- الطبق الثاني نضع بصمة الأصبع في منتصف الطبق أو نأخذ ماسحة قطنية معقمة و نمسح بها سطح الجلد ونخطط على سطح الوسط الغذائي في الطبق تخطيطاً متعرجاً .
3- الطبق الثالث نقوم أولاً بأخذ مسحة من الحلق بواسطة ماسحة قطنية معقمة ثم نقوم بالتخطيط على سطح الوسط الغذائي في الطبق تخطيطاً متعرجاً مع مراعاة العمل تحت ظروف التعقيم .
4- نقوم بوضع الأطباق الثلاثة في الحضان عند 37 ْم لمدة 24 – 48 ساعة ثم نقوم بأخذ النتائج وتسجيلها .

** وتجدر الإشارة إلى وجوب معرفة كيفية أخذ النتائج وذلك من خلال التعرف على طريقة عد المستعمرات البكتيرية والمقارنة بين العينات المختلفة من حيث عدد الكائنات النامية وكذلك التعرف على صفات المستعمرات البكتيرية التي يمكن التعرف عليها من خلال المشاهدة بالعين المجردة ويمكن معرفة ثلاث خاصيات أساسية للمستعمرات البكتيرية وهي شكل المستعمرة البكتيرية وارتفاعها وشكل حافتها .
والشكل التالي يوضح هذه الخواص .

الشكل يوضح الصفات المزرعية للمستعمرات البكتيرية مرتبة كما يلي

الصفات المزرعية CULTURAL CHARACTERISTICS
يشتمل هذا الجزء التعرف على خواص المستعمرات البكتيرية باتباع عدة أسس ومنها :

1- شكل المستعمرة Form : تتخذ المستعمرة الفردية لكائن بكتيري معين شكلاً من الأشكال التالية عند تنميته على بيئة صلبة .
أ) جذرية Rhizoid
ب) شجرية(خيطية) Filamentous
ج) غير منتظمة Irregular
د) دائرية circular
هـ) نقطية Punctiform
و) مغزلية Spinal

2- ارتفاع المستعمرة Elevation
أ) مقعرة concave
ب) مرتفعة من المنتصف Umb onate
ج) مستوٍ أو مسطحة Flat
د) محدب Convex
هـ) مرتفع Raised

3- حافة المستعمرة Margin or edge
أ) مفصصة Lobate
ب) مسننة Erose
ج) خيطية Filamentous
د) متموجة Undulate
هـ) كاملة أو منتظمة Entire
و) مجعدة Curled

4- سطح المستعمرة Surface of colony
أ) ناعم Smooth ب) خشن rough
ج) حلقات مختلفة الأقطار متحدة المركز concentrically ringed
د) مقسمة قطرياً radiately ridged

5- الصفات الضوئية للمستعمرة Optical features
أ) معتمة Opaque لا تسمح للضوء بالمرور خلالها
ب) نصف شفافة Translucent
ج) نصف شفاف لامع Opalescent

6- قوام المستعمرة Consistency يمكن وصف قوام النمو في حالة المزارع النامية على الآجار المائل باستعمال نفس الصفات .
أ) زبدي Butyrous مثل قوام الزبدة
ب) لزج Viscid يعلق النمو على ابرة التلقيح عند ملامسته أي مخاطي القوام
ج) غشائي Membranous
د) هش Brittle نمو جاف يتكسر عند ملامسته ابرة التلقيح
** يمكن وصف النمو على الآجار المائل بما يلي من صفات :
1- كمية النمو Amount of growth
أ‌) ضئيل Scanty
ب‌) متوسط Moderate
ج) غزير Abundant

2- شكل النمو Form of growth
أ) خيطي Filiform نمو متماثل على جانبي خط التلقيح
ب) مسنن Echinulate النمو حول خط التلقيح له حواف مسننة أو مدببة
ج) خرزي Beaded عدة مستعمرات منفصلة أو شبه متصلة على طول خط التلقيح
د) منتشر Spreading يزداد النمو بشكل واضح بعيداً عن خط التلقيح
هـ) جذري Rhizoid متفرع كتفرع الجذر .
و) شجري Arborescent مثل تفرع الشجر .

3-إنتاج الصبغة Pigmentation
من الصفات المزرعية الهامة في التصنيف إنتاج الصبغات أو إنتاج اللون فمن الأنواع البكتيرية ما ينتج صبغة تبقى في داخل الخلية ينتج عنه مستعمرات ذات لون معين مثل بكتيريا Sarcina luteu ذات اللون الأصفر الليموني وبعض أنواع البكتيريا تنتج صبغات تفرز خارج الخلية تلون البيئة مثل أنواع تابعة لجنس Pseudomonas .
ويلاحظ أن كثافة الصبغة تتأثر بتركيب البيئة فمثلاً تتكون بعض الصبغات في وجود الأحماض في البيئة أو السكريات أو بعض الأحماض الأمينية , ويمكن أن يكون لظروف التحضين تأثير على إنتاج بعض الأصباغ البكتيرية .

4- الرائحة Odor
أ) النمو ليس له رائحة .
ب) النمو له رائحة و في هذه الحالة يذكر مدى تشابهها للروائح المعروفة .
** ويمكن وصف النمو في بيئة المرق المغذي كما يلي :
1) النمو السطحي Surface
أ) لايوجد نمو سطحي .
ب) حلقي Ring النمو على شكل حلقة محيطة بالسطح .
ج) قشري Pellicle النمو على شكل قشرة رقيقة تغطي السطح .
د) متجمع Flocculent نمو على شكل كتل ملتصقة ببعضها لها أشكال مختلفة تطفو على سطح المزرعة السائلة .
هـ) غشائي . Membranous

2- النمو تحت السطح Subsurface
أ‌) لايوجد نمو .
ب‌) عكر Turbid .
ج) حبيبي Granular على شكل حبيبات صغيرة .
3- النمو المترسب Sediment .
أ) لايوجد راسب .
ب) راسب حبيبي Granular .
ج) راسب متكتل Flocculent .
د) راسب لزج Viscid .
هـ) راسب قشري Flaky على شكل قشور رقيقة منفصلة .

4- كمية النمو Amount of growth .
النمو في جميع أنواع البيئات توصف كميته كما يلي :
أ) قليل Scanty .
ب) متوسط Moderate .
ج) غزير Abundant .