دراسة الكائنات الحية الدقيقة , طرق التعقيم , Studying of microorganism

تمـهـيد :

الأحياء الدقيقة هي كائنات ممعنة في الصغر وتشمل العديد من الأنواع منها البكتيريا Bacteria والفطريات Fungi والفيروسات Vruses والأوليات Protozoa وبعض أنواع من الطحالب Algae , وتنتشر هذه الكائنات في جميع الأوساط والبيئـات بشـكل متداخل .
ولكي نتمكن من دراستها يجب توفير أوساط غذائية Media مناسبة لها ومحتوية على المواد والعناصر اللازمة لنموها وتكاثرها مع مراعاة توفير الظروف البيئية الملائمة مثل درجة الحرارة والرطوبة المناسبة ودرجة الحموضة PH . كما ويلزم توفير النسب المناسبة من الأملاح والفيتامينات والمواد العضوية , وهذا لتوفير وسط مشابه للوسط الذي تعيش فيه الكائنات الحية الدقيقة .

ملاحظة هامة:

تعتمد دراسة الكائنات الحية الدقيقة على عدة أسس هي :
1- عزل الميكروبات Microbes isolation من الأوساط التي تعيش فيها سواءاً كانت صناعية أم طبيعية للتمكن من دراستها .
2- زراعتها بصورة نقية Isolation of pure culture ويلزم ذلك تنميتها في أوساط غذائية خاصة تتوفر فيها جميع الإحتياجات الخاصة لنموها .
3- توفير الظروف البيئية الملائمة لمعيشتها مثل الرطوبة و درجة الحرارة و غيرها .
4- التعقيم Sterilization .
وسنقوم بدراسة كل أساس من هذه الأسس بالتفصيل كل على حدى وأول هذه الأسس التي سنقوم بدراستها هو التعقيم نظراً لأهميته.

التعقيم Sterilization

تعريف التعقيم :
هوالعمليات التي من شأنها قتل وإزالة جميع الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في البيئات وعلى المواد والأدوات المستعملة لجعلها خالية تماما منها . حيث أن معظم الدراسات الميكروبية تعتمد على المزارع النقية للحصول على نوع واحد من الميكروبات التي تنمو على بيئات خاصة معقمة.
وهناك عدة طرق متبعة للتعقيم ومنها :-

طرق التعقيم وتطبيقات عليها :
هناك عدة طرق متبعة في التعقيم وهي :
1- الطرق الفيزيائية .
2- الطرق الكيميائية.
3- الترشيح .
4- الإشعاعات .

أولا : الطرق الفيزيائية Physical methods :

.أ. الحرارة Sterilisation by heat : من أكثر الطرق استخداما في التعقيم وتشمل نوعين :
1- الحرارة الجافة dry heat : ويستخدم بها الحرارة الخالية من بخار الماء لذا فهي تحتاج إلى وقت أطول ودرجة حرارة عالية في بعض الأحيان وتستخدم في عدة تطبيقات منها :
أ- التعقيم باللهب المباشر direct flaming : يستخدم اللهب المباشرمن موقد بنزن في تعقيم بعض الأدوات التي يمكن تعريضها للحرارة المباشرة مثل إبر التلقيح Inoculating needle وهي تضمن القضاء على جميع الكائنات الدقيقة العالقة وتبقى هذه الأدوات معقمة ما دامت محمية من أي تلوث لاحقاً .

تعقيم إبرة التلقيح باللهب المباشر

أ‌- التعقيم بالتلهيب الكحولي alcohol flaming :
وتستخدم في هذه الطريقة مادة كحولية مثل الإيثانول لغمس الأدوات المراد تعقيمها ثم تعرض للهب المباشر وتترك مشتعلة حتى تطفأ النار بنفسها , مثل المشارط والملاقط والمقصات , ولكن يجب مراعاة الحذر.

ج- التعقيم بأفران الهواء الساخن hot air ovens :
ويستخدم لذلك أفران جافة تعمل بالغاز أو الكهرباء وتكون مزودة بضابط للحرارة بحيث تستخدم درجة حرارة بين 150-180 درجة مئوية وزمن بين 3- 5 ساعات . ويمكن تعقيم الأدوات الزجاجية أو المعدنية بهذه الطريقة .

2- التعقيم بالحرارة الرطبة moist heat : وتشمل

أ‌- التعقيم بالبخار تحت الضغط Steam-under-pressure sterilization :
يوفر البخار تحت الضغط أكثر الطرق استخداما في عملية التعقيم ويستخدم لهذه الطريقة وعاء يشبه لحد كبير قدر الضغط المستخدم في طهي الطعام ويسمى هذا الوعاء ( الأوتوكليف autoclave ) وهو مزدوج الجدار ومزود بجهاز تحكم ذاتي توضع به كمية معينة من الماء ويتم تشغيله بالكهرباء مع مراعاة فتح الصمام لتفريغ الهواء الداخلي وإحلاله ببخار الماء .
والضغط المستخدم في التعقيم هو 15 رطل/بوصة مربعة ( 1.5 ضغط جوي ) ودرجة حرارة 121 درجة مئوية ( ولذلك تضبط درجة التعقيم إما بزيادة الزمن أو بزيادة الضغط ) والزمن اللازم هو 15-20 دقيقة .
وتستخدم هذه الطريقة في تعقيم البيئات الغذائية والمعدات المعملية مثل الملابس والمواد التي تتلف بالحرارة الجافة حيث أن الرطوبة لها تأثيرقوي على الجراثيم التي تعد مقاومة للحرارة كما أن لها تأثيرا على التراكيب البروتينية للميكروبات فتعمل على تخثرها .

ب- التعقيم بالبخار المستمر أو بالغليان ( التعقيم المتقطع )Intermittent sterilisation :

يستخدم لهذه الطريقة جهاز يسمى بجهاز (ارنولد Arnold sterilizer ) ويعمل على إنتاج بخار ساخن يرتفع من القاعدة إلى الجزء الأعلى ويجري التعقيم بهذه الطريقة على ثلاث مراحل لمدة ثلاثة أيام متتالية وتعرف هذه الطريقة بالتعقيم المتقطع Fractional sterilization .
ويجري التعقيم فيها بتسخين البيئة يومياً لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 100 درجة مئوية ثم تحضن على درجة حرارة 30-37 ْم إلى اليوم التالي وهكذا .
وتعتمد هذه الطريقة على موت الخلايا الخضرية في اليوم الأول ,أما الخلايا البكتيرية المكونة للجراثيم الداخلية والمقاومة لدرجة الحرارة ففي اليوم الأول سيحدث لها إنبات وتتحول إلى خلايا خضرية فيتم القضاء عليها في اليوم الثاني أما اليوم الثالث فيتم إجراء هذه العملية للتأكد من موت جميع الخلايا في الوسط الغذائي وضمان إتمام التعقيم
ويفضل استخدام هذه الطريقة في البيئات التي تتأثر بدرجات الحرارة العالية التي تزيدعن 100 ْم .

جهاز ارنولد
3- التعقيم بالإشعاعات Radiation :

تعد الأشعة الفوق بنفسجية من أهم الإشعاعات المستخدمة في عملية التعقيم حيث لها قدرة عالية على إبادة جميع الكائنات الدقيقة السطحية بحيث أن الطول الموجي لها المقدر بين 2600 – 2700 أنجستروم وهو النطاق الفعال في إبادة الأحياء الدقيقة .
وتستخدم هذه الطريقة في تعقيم أسطح مناضد العزل في المعامل وهواء المعمل والأدوات التي تتأثر بالحرارة .
كما يمكن استخدام أشعة جاما ذات التأين عالي الطاقة وأشعة السيزيوم في تعقيم بعض المواد الصيدلانية .

4- التعقيم بالمرشحات Filtration :

وتعد من الطرق الميكانيكية و تستخدم هذه الطريقة في تعقيم بعض المحاليل التي تتأثر بالحرارة بتمريرها على مرشحات خاصة تعرف بالمرشحات البكتيرية ( يتراوح قطر ثقوبها بين أقل من 1 ميكرون إلى عدة ميكرونات ) مثل بعض السكريات وسيرم الدم وهذه المرشحات تعمل بطريقتين :
 بالتأثير الميكانيكي الذي يعمل كالغربال الذي يحجز الميكروبات من المرور بسبب الدقة المتناهية لثقوب المرشح .
 بالإدمصاص للميكروبات نتيجة اختلاف الشحنات الكهربية بين المرشح وخلايا الميكروب .
ومن المرشحات المهمة ما يعرف بالمرشحات الغشائية membrain filters والتي تتكون من السليلوز أو غشاء من البلاستيك ثقوبه ذات حجم صغير تكفي لحجز البكتيريا وإزالتها من المحاليل ومنها ذات مسامات دقيقة جدا ذات قدرة عالية على إزالة الفيروسات والتراكيب الدقيقة .
ومنها مرشحات الزجاج المسامي , و المرشحات البكتيرية الزجاجية , و المرشحات الخزفية مثل مرشح تشامبرلاند وسيلاس , ومرشح سايتس المصنوع من الإسبستوس المضغوط , والمرشحات الدياتومية مثل مرشح ماندلر .
وكل أنواع المرشحات تكون متصلة بأنبوب تفريغ يعمل على خلخلة الضغط للحصول على الترشيح الجيد والتخلص من البكتيريا .

ثانيا :التعقيم بالطرق الكيميائية Chemical methods :

تستخدم في هذه الطريقة بعض المواد الكيميائية في عملية التعقيم ذات التأثير المميت أو المثبط لنمو الكائنات الدقيقة , ويؤخذ على هذه الطريقة عدم فعاليتها نظراً لبقاء المبيدات القاتلة للميكروبات على الأدوات الزجاجية والتي تمنع نمو الكائنات المطلوبة كما وأنها قد لا تكون فعالة تماما على الجراثيم البكتيرية . ومن هذه المواد :
1 – الكحول الإيثيلي Ethyl alcohol : ويستخدم عادة بتركيز50-70 % في تطهير الأيدي والأسطح وذلك من خلال تجفيف الخلايا Dehydration وإذابة الدهون وترسيب البروتين Coagulation .
2- الفينول Phenol : يستعمل بتركيز 2 – 5 % للتعقيم السطحي لأرضيات المعامل والعيادات وأسطح المناضد بحيث ترسب البروتين الخلوي وتخرب الغشاء الخلوي .
3- كلوريد الزئبق : يستخدم بتركيز 0.1 % لأغراض التعقيم السطحي للبذور النباتية أو المناضد.
4- الفورمالين والديتول : يستخدمان كمواد مبيدة للميكروبات بتركيز 2- 5 % في المواد التي تتأثر بالحرارة مثل أدوات الجراحة وموازين الحرارة وأسطح العزل وتسمى بمبيدات الميكروبات Bactericidal .
وتقسم المبيدات الميكروبية إلى مطهرات الجلد ومطهرات الأشياء و منها :
– أملاح المعادن الثقيلة مثل كلوريد الزئبق .
– الهالوجينات مثل اليود ويستخدم كمحلول بتركيز 2% لتعقيم الأيدي وكذلك غاز الكلور.
– الكحولات مثل الكحول الإيثيلي .
– الألديهيدات مثل الفورمالدهيد .
– الفينولات مثل الفينول .
5- التعقيم بغاز أكسيد الإيثيلين Ethylene oxide ( كاربوكسيد ) :
يستخدم غاز أكسيد الإيثيلين المضغوط في تعقيم الأدوات البلاستيكية والماصات والأدوات التي تتأثر بالحرارة وبعض المحاليل بحيث يخلط أكسيد الإيثيلين بثاني أكسيد الكربون أو غاز الفريون قبل الإستخدام لمنع اشتعاله أوالإنفجار, وهو ذو سمية عالية للكائنات الدقيقة وهو سهل التداول وغير مكلف في عمليات التعقيم ويمكن التخلص من الكميات الزائدة بسهولة عن طريق التهوية .